天津医科大学总医院性病门诊患者生殖支原体检测.docVIP

天津医科大学总医院性病门诊患者生殖支原体检测 　　【第一作者简介】王 双（1975-），女，河北沧州人，主治医师，硕士，主要研究方向为性传播疾病及化妆品皮炎的防治。 　　【摘 要】 目的:建立聚合酶链反应技术(PCR)检测天津医科大学总医院性病门诊患者的分泌物标本中的Mg-DNA，以了解生殖支原体感染在此性病门诊患者中的发病情况。方法：采用PCR法对泌尿生殖道分泌物标本进行检测，并同时采用了两对不同的引物同时进行检测。结果：共有8例患者生殖支原体阳性，其阳性率为3.57%。结论：天津医科大学性病门诊患者中存在生殖支原体的感染，但阳性率较低。 　　【关键词】 生殖支原体； 聚合酶链反应 　　 　　生殖支原体(mycoplasma genitalium，Mg)是Tully于1981年首次从2例非淋球菌性尿道炎病人的分泌物中分离到的病原微生物，它与人类的尿道炎、宫颈炎或盆腔感染密切相关[1]。我国对Mg的研究起步晚，对其了解还很少。我国的广州、南京、辽宁等地区有学者对不同人群的Mg感染情况进行了检测，但华北地区对此研究较少，特别是天津地区还无人对Mg进行检测和研究。 　　本实验用PCR法对性病门诊患者的分泌物标本进行了Mg-DNA的检测，并对两对引物检测的结果进行了比较，从而保证结果的可靠性，这为了解Mg在天津地区高危人群中的感染情况、Mg在性传播疾病中的作用提供了参考依据。 　　 　　1材料和方法 　　 　　1.1菌株 　　Mg标准株：MgG-37，由东南大学流行病教研室提供；衣原体标准株E型，由天津市性传播疾病研究所提供；白念珠菌标准株(ATCC-11006)；加特那菌标准株(ATCC14018)。 　　 　　1.2标本采集 　　来天津医科大学总医院性病门诊就诊的患者224例，其中男性181人，女性43人。这些患者均有婚外性接触史，性伴数≥1，就诊一个月内未使用大环内酯类、四环素及喹诺酮类抗菌药物。采集方法：用铁杆棉拭子插入男性尿道或女性宫颈内2~3cm，留置2s，旋转4周后取出。把用于Mg检测的拭子置于含1ml灭菌生理盐水的?Eppendorf?管中，洗涤拭子，标本-20℃储存备用。 　　 　　1.3PCR方法 　　1.3.1标本处理取1m1分泌物标本，离心12000r／min×20min，弃上清液，向沉淀中加裂解液(50mM KCl，2.5mM MgCl2，10mM Tis-HCl（PH8.3），0.1g/L明胶，0.45%NP-40，0.45%吐温20，200mg/L蛋白酶K 90μl。混匀，55℃水浴90分钟，沸水浴15min灭活蛋白酶K后，再12000r/min离心3min，取含有DNA的上清液，做PCR扩增的DNA模板。 　　1.3.2引物本试验采用了由Jensen设计的两对引物。①Mg-Pa引物：MgPa1 5＇…AGTTGATGAAACCTTAACCCCTTGG…3＇；MgPa3 5＇…CCGTTGAGGGGTTTTCCATTTTTGC…3＇，预期扩增片断长度为281bp。②Mg的16S-rRNA引物：Mg16S-45F: 5＇…TACATGCAAGTCGAACGCAAGTAGC…3＇, Mg16S-44R: 5＇…AATCTCCAGCCATTGCCTGCTAG…3＇，预期扩增片断长度为402bp。 　　 　　1.3.3 PCR反应体系及条件25μl反应体系中依次加入10×PCRBuffer2.5μl，Mg2＋1.5μl，0.2mMeach的dNTPmix，0.48μM MgPa1(Mg16S-45F)，0.48μM MgPa3(Mg16S-44R)，临床标本提取物8μl（Mg标准株5μl），Taq DNA聚合酶0.625u。 　　反应条件：两对引物的反应条件相同。94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸 60s，共40个循环后；72℃后延伸5min，使反应完全。 　　反应结束后，以1.5％琼脂糖凝胶电泳30min，在透射式紫外灯下观察结果并摄像，出现与标准株PCR产物在同一水平的亮光带标记为阳性。每批标本设阳性及阴性对照，前者加Mg标准株，后者为阴性水对照。 　　 　　1.4敏感性及特异性试验 　　取标准株MgG-37 DNA以2倍稀释法进行各浓度的扩增。用各种相关微生物分别进行两对引物的特异性试验。 　　 　　2结果 　　 　　2.1阳性临床标本的扩增结果(图1) 　　其中泳道5为DNA Marker(由下至上为)100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp；泳道2，3以MgPa1/MgPa3为引物、泳道7，8以Mg16S-45F/Mg16S-44R为引物的临床标本的PCR扩增产物，分为281b