荧光定量pcr探针设计 定量PCR Taqman探针设计要领.docVIP

荧光定量pcr探针设计 定量PCR Taqman探针设计要领 导读：就爱阅读网友为您分享以下“定量PCR Taqman探针设计要领”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对92的支持! 5 → 3’ 5’ FAM→3’染料 NNNNNNN NNNNNNN 发表序列：5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 互补发表序列 3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’ NNNNNNN 3’ ←5’ reverse primer 或： reverse primer 5 → 3’ NNNNNNN 发表序列： 5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 互补发表序列 3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’ NNNNNNN NNNNNNN 料染3 ← MAF5’ 3 ’← 5’ Taqman probe forward primer Taqman probe forward primer 三 引物的设计 1． 上下游引物要保守 为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守，最好不要有不同的碱基，若不得不有时，也必须保证引物的3端至少有4个碱基是完全保守才可。 在设计保守引物时，要在发表序列上分别找保守一致的区域，即在发表序列的5端引物位置找的是3端至少有5个bp保守，在即在发表序列的3端引物位置找的是5端至少有5个bp保守。 5NNNNNNN 3’ 发表序列：5-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’NNNNNNNNN 5’ 2． 上下游引物的长度和Tm值 上下游引物的长度一般为18-25bp之间，且Tm值在58-60之间。确保引物中GC含量在 30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3端最好不为G或/和C。引物3端的5个碱基不应出现2个G或/和C。 上游引物应标记F(forword)，且在基因组的位置及长度；下游引物应标记R(reverse)，且在基因组的位置及长度。用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超过2，长度相差最好不超过4bp。 3． 引物的评价 用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入引物的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的引物序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“primer self dimer”,分析引物的二聚体。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个dimer，并对此引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primer hairpins”,分析引物的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个hairpins，并对此引物的hairpins进行评价。再选择所需要的上下游引物，在“report”菜单下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好(dG值通常为负值)，绝对值超过4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行)。不必考虑引物与探针之间的配对与发夹结构，因为探针的Tm值非常之高。 4． 上下游引物与探针的距离(上下游引物的位置) 理论上讲，上游引物的3端离探针的5端为1-20bp，最佳是1bp，最近为上游引物的3端离探针的3端为4bp；下游引物要与探针有一定的距离，但要保证下游引物的3端离探针的3端最为15-150bp。整个目的片段的长度最好在50-150bp之间，最长不超过200bp。 5． 简并引物的设计 当为了能够同时扩增即使在引物位点也有突变的目的片段，若多个碱基出现的概率相同，就要在此位点，设计一个代表多个碱基的简并子。在合成引物时，在合成到此位点时，就不是加入一个碱基，而是同时加入简并子所代表的多个碱基。这样，实质合成的引物是多条引物，只不过是在简并子位置碱基不同而已。但简并引物要考虑每条引物的Tm值，确保简并子所代表的不同碱基的不同引物Tm值相差不超过2。若超过2，在确保引物的3端引物相同时，在Tm值较