双价抗虫基因PtaCrylAc番茄的遗传转化研究.pdf

农杆菌介导的双价抗虫基因Pta-CrylAc 番茄的遗传转化研究 摘 要 本研究优化了番茄的再生体系和农杆菌介导的番茄转化体系，并构建了应用于农 杆菌介导法转化的双价抗虫载体pCAMBIA3300-bt-pta，以番茄品系Micro-Tom为材料 进行了番茄转化、转化番茄的分子生物学鉴定以及遗传学分析，并初步进行了转基因 番茄的抗虫鉴定工作，主要结果如下: 1优化了农杆菌介导番茄转化的几个影响因素:① 外植体长度在5。左右有利于愈 伤组织的形成;② 光照培养比暗培养更有利于愈伤组织的形成;③ 农杆菌侵染 时间为8-10分钟:④菌液浓度OD6。约为0.15;⑤侵染液pH=5.2;⑥乙酞丁 香酮使用浓度为50umol/L;⑦ 共培养时间为三天时获得了最高的转化效率;⑧ 选用狡节青霉素为抑菌剂，浓度为300mg/l;⑨ 以PPT作为选择剂时的浓度为 4mg/lo 2 以pCAMB工A3300为骨架，在此基础上构建了含半夏凝集素和苏云金芽抱杆菌的双价 抗虫载体，并以根癌农杆菌LBAIIOO为侵染菌转化番茄。并且，转化后从325个外 植体获得再生植株24株，再生率为8.5%. 3对转化的24株再生植株中进行TPCR检测,RT-PCR检测以及Southernblot检测， 并且确定阳性植株为15株，转化率为62.5%0 4对T工植株进行了抗虫基因众FZ刁。分离分析，结果符合孟德尔规律，阳性和阴性之 比为3;1:并且抗虫基因CryIA和‘抗虫基因尸艺a共分离。 5对T,植株进行了除草剂抗性检测，抗除草剂有效成分PPT在20mg/la 6对TI代植株BP-1^BP-7进行了小菜蛾幼虫初步抗性鉴定，抗虫性程度较为显著， 但不同植株差异较大。 关键词:番茄，CrylAc,Pta，根癌农杆菌，遗传转化，抗虫 vita ThegenetictransformationofPta-CrylAcintomato Agrobacterium-mediation Abstract AnefficientregenerationsystemandAgrobacterium-mediatedtransgenicsystemwasestablishedin tomato.AplantexpressionvectorpCAMBIA3300-bt-ptaharboringtwoinsecticidalgeneswas constructedandemployedinAgrobacterium-mediatedtomatotransformation.Themolecularassay, geneticsanalysisandinsect-resistancetestwereperformedsuccessfullytotarnsformedtomatovariety Micro-Tom.Themajorresultssummarizedbellow: I AnefficientandrapidAgrobacterium-mediatedtransformationprocedurehasbeenestablished: (!)Theexplantin5mmlongwasoptimalforcallusinduction.)Somel2hoursilluminationwas suitableforcallusinduction.I(Theoptimaltimecourseforinoculationwas8-10minutes.(4)IOptimal concentrationofagrobacteriaforinoculationwasODa,u=0.15⑥Acidicsolutionforinoculation (pH=5.2).⑥ConcentrationofASwas50umol/Lininoculationsolution.⑦Co-cultivationfor3 days⑧Some300mg/ICa