实验方案：成年猪MSCs的培养及鉴定.doc

成年猪MSCs的培养新的实验方案 实验材料： 取材准备：骨髓穿刺针，50ml离心管（1个含有抗生素无血清30mlL-DMEM,1个30ml含抗生素的PBS溶液，1个含有30ml枸橼酸钠抗凝剂，2个空离心管），酒精棉球，枸橼酸钠（105mmol/l,即32g/l，与血液以1:9比例稀释）。 细胞分离准备：100ml无血清含抗生素的L-DMEM(洗液)，100ml含抗生素的PBS溶液，10ml离心管，5ml枪头和枪，离心管架，1.5ml离心管，1.5ml枪头和枪，percoll细胞分离液（1.073g/ml），毛细微管，35x10（小）培养皿，培养瓶（25cm2,75cm2）,10%血清L-DMEM,废液缸。 溶液配制：电子天平，称量纸，钥匙，磁力搅拌器，转子，5ml注射器，100ml烧杯，250ml烧杯，100ml量筒，250ml滴流瓶，100ml滴流瓶，一套滤器，废液缸，瓶塞，ph计，1M盐酸，1M氢氧化钠， 枸橼酸钠：3.2g/100ml. 3.2g枸橼酸钠+100mlDMEM 肝素钠(140iu/mg)：200iu/ml 0.01M PBS ：Nacl 8g, kcl 0.2g, Na2HPO4 1.44g ,KH2PO40.24g, 先加入800ml蒸馏水，然后调节Ph到7.2-7.4，最后加水定容到1L,高压灭菌20min,最后加入50μg/ml卡那霉素。 1.073g/ml percoll分离液：储存液，percoll原液：8.5%Nacl=9:1; 工作液：10ml储存液+7.544ml0.85%氯化钠。 L-DMEM洗液：将原粉L-DMEM倒入容器中，然后用注射器抽超纯水冲掉残余的原粉，然后加入800ml超纯水搅拌溶解后，加入3.7g/l NaHCO3,完全溶解后加入5.958g/l HEPES,完全溶解后，调节PH到7.2-7.4，过滤，然后加入50μg/ml卡那霉素和300μg/ml的两性霉素B。 L-DMEM完全培养液：配制方法同上，最后加入10%胎牛血清和0.5μg/ml的两性霉素B，要求做对照，一份为未经过过滤的含有10%胎牛血清的L-DMEM,另一份为经过过滤的含有10%胎牛血清的L-DMEM. 1M HCl：取9ml盐酸加水到100ml，按照37%浓度计算，盐酸的密度为1.19，即9*1.19*0.37/36.46=1.087mol/l.然后通过过滤或离心，贴上标签。 1M NaOH：欲配制100ml,则m=1*0.1*40=4g.将称量好的氢氧化钠加入烧杯中，然后加入蒸馏水将其溶解，待完全溶解后，用蒸馏水定容轻轻摇动，使溶液混合均匀，然后进行过滤或离心。贴好标签。 注释： （1）取材，离心稀释用PBS的培养皿标记为A （2）取材，离心稀释用L-DMEM的培养皿标记为B. （3）毛细吸管要在使用前用酒精灯灼烧灭菌或者高压灭菌。 （4）取材溶液，调PH溶液以及离心洗涤溶液均应该过滤或离心。 实验步骤：1，成年猪骨髓间充质干细胞的采集： 提前一天进行骨髓穿刺针和50ml离心管的高压灭菌，对保温箱清洗并消毒，冷冻冰袋，准备10ml注射器，酒精棉球，器材包装袋。取材用的含抗生素的L-DMEM洗液和PBS. 首先用枸橼酸钠冲洗骨髓穿刺针，防止采集过程中出现凝血块，然后用酒精棉球擦拭骨髓穿刺针，进行股骨腔，髂骨多点穿刺，要求穿刺最后，每个空离心管中含有50ml以上的混合液。每次穿刺后，都要用酒精棉球擦洗穿刺针头，并用抗凝剂冲洗骨髓穿刺针。将用PBS和L-DMEM的不同冲洗液标记并放到不同的离心管中，取材最后要求离心管用酒精棉球擦洗，然后封装到含有冰块的保温盒中，并颠倒数次，防止出现血凝块。 2，成年猪骨髓间充质干细胞的分离培养： （1）将采集的猪骨髓在2h之内拿到实验室，并颠倒数次防止沉淀凝集，然后用酒精棉球擦拭干净然后放入4度冰箱，开始进行无菌操作台的擦拭，所需物品摆放，紫外消毒。20min后开始操作。 取出7只10ml离心管，每管加入7ml混悬液，要求无菌操作，在没有灼烧要求的条件下，关闭酒精灯。然后离心，480g,5min.去除上清液，加入相应的L-DMEM或PBS进行再次离心，离心3次一共，最后将离心沉淀收集到50ml 离心管中，加入15ml相应的稀释液进行稀释，根据分层离心液的多少制定稀释液的量（1.073g/ml percoll分离液，按照分离液和细胞悬液2:1比例，则细胞悬液至少要10ml）。要求加入0.8ml percoll分离液+0.4ml细胞悬液。800g,25min.然后用毛细吸