分子内裂G-四链体脱氧核糖核酸酶用于Hg2+特异性定量检测.docVIP

分子内裂G-四链体脱氧核糖核酸酶用于Hg2+特异性定量检测 　　摘 要 G-四链体DNA酶是由核酸G-四链体与氯化血红素（Hemin）结合后形成的一种具有过氧化物酶活性的人工酶，利用这种DNA酶，可进行多种化学及生物传感器的设计。为提高G-四链体DNA酶类Hg2＋传感器的选择性，本研究在传感器的设计过程中引入了分子内裂分G-四链体，即将形成G-四链体的富G序列拆分成两部分，分别放置在Hg2＋探测序列的两端。在无Hg2＋存在时，部分富G序列被包埋在某一分子内二倍体结构中，无法形成G-四链体。而在Hg2＋存在下，Hg2＋对T-T碱基错配的稳定能力可以促使Hg2＋探测序列形成分子内二倍体结构，并伴随着原有分子间二倍体结构的破坏及分子内裂分G-四链体的生成。利用生成的裂分G-四链体与Hemin作用后检测体系酶活性的提高，实现Hg2＋传感器的设计。利用该传感器，可在50～?500 nmol/L及2.0～7.5 　　?SymbolmA@ mol/L两个浓度范围内实现Hg2＋的定量检测，检出限为47 nmol/L。由于裂分G-四链体DNA酶的使用强化了传感器对Hg2＋的依赖性，极大地提高了设计的Hg2＋传感器的选择性。对实际水样的加标回收结果显示，回收率为97.5%～104.5%，证明此传感器可以满足实际水样中痕量Hg2＋的分析要求。 　　关键词 脱氧核糖核酸酶; 裂分G-四链体; 传感器; 汞? 　　 2011-07-27收稿；2011-10-27接受 　　本文系国家自然科学基金（No.和973项目（No. 2011CB707700）资助 　　* E-mail:kongdem@nankai.省略 　　1 引 言 　　G-四链体是由富含鸟嘌呤碱基G的DNA或RNA序列形成的一种特殊的核酸二级结构[1]。G-四链体DNA酶则是由G-四链体与氯化血红素（Hemin）结合后形成的具有过氧化物酶活性的DNA酶[2,3]。与一些天然的过氧化物酶相比，G-四链体DNA酶具有价廉，易于制备、储存，易于修饰及水解稳定性和热稳定性好等优势。近年来，利用这类DNA酶，已设计了多种化学及生物传感器，包括核酸传感器、金属离子传感器及适配体传感器等[4～19]。 　　汞是一种常见的环境污染物。汞的污染极大地威胁着人类的健康，它可以引起脑部、肾脏损伤及多种认知和行动的紊乱。借助于G-四链体DNA酶，本课题组设计了一种Hg2＋传感器[20]。本方法利用Hg2＋存在下富G的DNA链从分子间二倍体结构向G-四链体结构的转化，以及随之所引起的检测体系酶活性的提高。虽然该传感器设计方案可以很容易地延伸用于多种金属离子及适配体底物的测定，但仅就Hg2＋检测而言，所面临的问题是少数几种金属离子（如Ni2＋， Co2＋， Cd2＋和Pb2＋）的存在会干扰Hg2＋的检测，尤其是Pb2＋的干扰，即使是在加入掩蔽剂PDCA（吡啶-2,6-二羧酸）时也无法消除。究其原因，Pb2＋对G-四链体的超强稳定能力导致其对检测体系中二倍体和G-四链体两种构型的平衡产生了严重的影响。Pb2＋的离子半径略小于K＋，同K＋一样，Pb2＋也可以进入到G-四链体的两个G-四分体平面中间，并对G-四链体结构起到稳定作用。相比于K＋稳定下的G-四链体，Pb2＋稳定下的G-四链体结构更加紧凑、稳定性更高。即Pb2＋对G-四链体的稳定能力更强[21]。若上述Hg2＋检测体系中存在Pb2＋，由于Pb2＋推动二倍体?G-四链体平衡向G-四链体方向移动，将会导致体系酶活性提高，进而产生正干扰。为了消除Pb2＋等的干扰，本研究对前述Hg2＋传感器的设计进行了改进，即将形成G-四链体的富G序列拆分成了两段，而将Hg2＋探测序列插入这两段富G序列中间。只有当Hg2＋探测序列在Hg2＋的存在下进行适当折叠后，两段富G序列才能相互接近，进而折叠成分子内的裂分G-四链体DNA酶。这样的探针设计可以增加G-四链体结构的形成对Hg2＋的依赖性，进而减弱甚至消除Pb2＋的干扰。2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　UV-1901紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），配有微量池架；40 　　?SymbolmA@ L的微量石英比色池（England，Starna Brand）；Jasco J-820分光偏振器。 　　实验中所用到的寡核苷酸链均从上海生工生物技术有限公司定制合成。其浓度以单链浓度的形式表示，通过测量260 nm处的吸光度值除以相应的摩尔吸光系数计算得到[22]。每条寡核苷酸链的摩尔吸光系数由以下网站上提供的软件计算得出（http://www.省略/analyzer/Applications/OligoAnalyzer）。配制的储备液于 　　?Symbolm@@ 20 ℃