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细菌DNA的提取方法
细菌DNA的提取方法
针对一些不易于提取的细菌的方法:
试验试剂：
抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)
25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl
10MLiCl
2MLiCl
DEPC-water（抑制RNA酶活性）
3MNaAc(pH5.2)
96%乙醇
70%乙醇
试验步骤：
1、抽提缓冲液65预热。
2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65，10min。
3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。
4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。
5、重复再作一次步骤4。
6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。
7、以2,000rpm，离心10min。
8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。
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较为常用的细菌DNA提取方法：
实验步骤：
1、将菌株接种于液体LB培养基，37震荡培养过夜。
2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。
3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37温育1h.
4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65温育10min。
5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。
6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．
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真菌DNA提取总结的两种方法：
第一种方法：
试验步骤：
1、取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。
2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。
3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。
4、以4，1000rpm，离心5min。
5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4，10,000rpm，离心5min。
6、取上清，加入2/3倍体积的-20预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。
7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。
8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37下处理1h。
9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4，10,000rpm，离心5min。
10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,2.5倍体积的无水乙醇,-70沉淀30min以上。
11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20保存备用。
DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。
第二种方法：
试验步骤：
1、真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。
2、加入3mL65预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65水浴30min,期间混匀2-3次。
3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。
4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4离心5min）。
5、取上清，加入2/3倍体积的-20预冷异丙醇,混匀,静置约30min。
6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。
7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37处理1h。
8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4，10,000rpm，离心5min。
9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70沉淀30min以上。
10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20保存备用。?
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细菌基因组DNA的提取方法综述，提供了5种方法。 ? 1 快速微量提取法 A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。 C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。 D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。 E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液
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