番茄dead-box解旋酶基因sldeah1的克隆与功能研究-cloning and functional study of tomato dead - box helicase gene sld eah 1.docxVIP

摘要解旋酶是一类在生物体内普遍存在的蛋白酶，它能够利用 NTP（主要为 ATP） 水解获得能量并促进双链 DNA（DNA 解旋酶）或 RNA（RNA 解旋酶）的解旋， 这种庞大的蛋白酶类广泛存在于病毒、人类等几乎所有的原核生物和真核生物中。 研究表明，DEAD-box 解旋酶在基本的细胞过程中起到了非常重要的作用，参与了 从细菌到真核生物细胞几乎所有的生物过程，包括 RNA 代谢、基因表达调控、核 质运输、激素信号响应、核糖体发生和组装及抗非生物逆境反应等重要生命活动。 此外，DEAD-box 解旋酶还可以作为普通的分子伴侣在 RNA 折叠及 RNA-蛋白质 复合体加工等方面也起到了重要作用。番茄是研究果实成熟的模式植物，同时， 其生长周期较短及全基因组测序的完成也为研究番茄中基因功能提供了方便。本 研究根据已经报道的拟南芥、玉米中的 DEAD-box 蛋白，通过同源比对，在 NCBI 数据库中筛选得到了一个 DEAD-box 同源蛋白，命名为 SlDEAH1。生物信息学分 析结果表明其属于 DEAD-box 解旋酶家族 DEAH 类群。但到目前为止还未见番茄 中有关 DEAD-box 解旋酶的研究和报道，因此，番茄 SlDEAH1 基因的具体功能还 不清楚，为了进一步研究 SlDEAH1 基因在番茄生长发育、抗逆性、基因表达调控 及参与果实成熟等方面可能发挥的重要作用，本研究的主要内容及获得的主要结 果如下：1、根据已经报道的拟南芥、玉米等的 DEAD-box 蛋白，通过同源比对，在 NCBI 组数据库（//）中筛选得到了一个 DEAD-box 同源 蛋白，命名为 SlDEAH1（登录号：XP_004248028），根据其基因序列（登录号： XM_004247980）设计特异基因全长扩增引物，以野生型（WT）番茄 AC++果实 B 时期 cDNA 为模板，应用 RT-PCR 方法从野生型番茄(AC++)中克隆得到了该基因的 全长序列，经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出一条约为 2300 bp 的目的条带， 与预测条带大小一致。经 PCR 扩增片段回收纯化、克隆、测序后证明该片段为目 的基因片段。2、根据所获得的序列对 SlDEAH1 做了生物信息学分析，序列分析表明：该 cDNA 全长 2335bp，包括 2073 bp 的开放阅读框，编码 690 个氨基酸残基。二级结 构预测结果表明 SlDEAH1 蛋白存在 42.46%的 α 螺旋，34.35%的无规则卷曲， 16.38%的延伸链，6.81%的 β 折叠。亚细胞结构定位预测 SlDEAH1 蛋白位于质膜。 同源比对结果表明该蛋白具有 9 个非常保守的结构基序，对于 ATP 结合、水解及 RNA 结合的 解 旋 酶 活 性 是 必 需 的 。 保 守 结 构 域 搜 索 结 果 表 明 该 蛋 白 属 于 DEAD-box 解旋酶家族。3、采用双酶切方法，利用 pHINIBAL 中间载体构建了 SlDEAH1 的 RNAi 表达载体 pBIN19-iSlDEAH1。4、采用农杆菌介导的方法将构建的 RNAi 表达载体 pBIN19-iSlDEAH1 导入野 生型（WT）番茄 AC++的子叶外植体中，经抗性筛选、NPT II 检测及 qRT-PCR 基 因沉默效率检测获得沉默效率很高的阳性转基因番茄株系。5、以番茄管家基因 CAC（登录号：SGN-U314153）作为内参，采用实时定量 PCR 方法对 SlDEAH1 在野生型番茄 AC++、突变体 Nr 及 rin 不同组织中进行组织 特异性表达模式研究，结果表明：SlDEAH1 在野生型（WT）萼片、成熟叶以及老 叶中表达量较高，在 B+4 和 B+7 时期果实中的表达量最高，并且在果实的发育和 成熟过程中，该基因表达量有一个明显的上升趋势，在突变体 Nr 和 rin 中，从 B 时期开始 SlDEAH1 的表达量均依次下降。6、采用实时定量 PCR 方法研究 SlDEAH1 在高温（40℃）、低温（4℃）、脱水、 伤害、盐等胁迫条件下的表达，结果表明：高温（40℃）、低温（4℃）、脱水、伤 害、盐等胁迫不同程度的诱导了 SlDEAH1 的表达，但在根中该基因的表达受盐胁 迫抑制。7、通过实时定量 PCR 方法，研究 ABA、ACC、GA3、IAA、meJA、ZT 等激 素对 SlDEAH 表达的影响。结果表明 ABA、ACC、GA3、IAA、meJA 和 ZT 均不 同程度的诱导了 SlDEAH1 基因的表达，其中对 SlDEAH1 基因的表达诱导最明显的 是 ABA。8、表型分析及统计学分析结果表明 SlDEAH1 基因在番茄叶片生长发育过程 中发挥重要功能，并可能在果实生长发育过程中起到一定作用，但该基因