酶性质和制备c.pptVIP

第二章 酶的性质及制备 第一节 酶的作用特点 一.具有很高的催化效率 二.高度的专一性 三.酶的活性是受调节控制的 1.酶浓度的调节 2.激素调节 3.共价修饰调节 4.限制性蛋白酶水解 5.抑制剂和激活剂的调节 6.反馈调节 7.别构调节 8.金属离子和其他小分子的调节 9.蛋白质剪接 四.酶的辅因子 Simple protein; conjugated protein Apoenzyme or apoprotein; holoenzyme Apoenzyme: the protein part of an enzyme without its cofactor Holoenzyme: complete, catalytically active enzyme Apoenzyme + Cofactor = Holoenzyme A cofactor can be either a small organic molecules (coenzyme) or metal ions Prosthetic group; covalently bound organic compound or chelated metal ion coenzyme – tightly but not covalently bound organic compound 五.催化作用的特点 六.酶和底物的作用首先生成酶-底物络合物 七酶的活性部位 第二节 酶的分离纯化及酶活力的测定 一.酶的分离纯化 1.酶分离纯化的一般原则 (1)酶原料的选择 (2)选择有效的纯化方法 (3)防止酶失活变性 (4)酶活性的测定贯穿纯化的始终 2.酶的抽提 3.酶的纯化 (1)根据溶解度不同进行的纯化 ①盐析法 ②有机溶剂沉淀法 ③共沉淀 ④选择性沉淀 ⑤等电点沉淀法 (2)根据分子大小进行的纯化 ①凝胶过滤 ②超滤 ③超离心 (3)建立在电学解离性质进行的纯化 ①吸附层析 ②离子交换层析 ③疏水层析 ④反相层析 ⑤电泳分离 (4) 利用专一亲和作用进行的纯化 ①亲和层析 ②亲和电泳 ③融合蛋白亲和分离法 (5).根据稳定性差别建立的纯化方法 ①选择性热变性 ②选择性酸碱变性法 ③表面变性法 4.酶的纯度检验 (1)超速离心法 (2)电泳 (3)SDS电泳 (4)等电聚焦 (5)N-末端分析 (6)免疫技术 二.酶活力的测定 1.酶活力,活力单位,比活力 2.活力测定的注意事项 3.测定方法 (1)分光光度法 (2)旋光法 (3)荧光法 (4)电化学方法 (5)化学反应法 (6)同位素测定法 第三节 酶的性质 一.酶的物化性质 1.酶蛋白溶液的特性粘度 (1)基本概念 粘度,绝对粘度,相对粘度,比粘度,比浓粘度,特性粘度 (2)测定酶蛋白溶液特性粘度的意义 天然与变性蛋白质的特性粘度 2.酶蛋白的分子量 (1)超离心法 (2)凝胶过滤 (3)SDS-聚丙烯酰胺电泳和浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.酶的等电点 二.酶的催化性质 1.最适反应温度 2.最适反应pH 3.酶的热稳定性 4.pH稳定性 5.酶的贮存稳定性 6.酶反应的初速度 7.米氏常数的测定 8.抑制类型的判断和抑制常数的测定 9.底物专一性的研究方法 * * - 6.1 9.4 16.6 6.5 17.1 - 18.9 - 20.9 8.1 16.0 - 24.5 11.0 26.8 - 33.0 27.2 31.5 22.9 52.2 - 3.3 2.7 3.6 3.1 5.5 3.5 2.5 4.5 - 3.7 胰岛素 核糖核酸酶 溶菌酶 血红蛋白 肌红蛋白 卵类粘蛋白 木瓜蛋白酶 胰凝乳蛋白酶原 原肌球蛋白 胃蛋白酶 血清清蛋白 在浓盐酸胍溶液中的变性状态 具完整的S-S键