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分子生物学课件：基因重组 (RecA在单链DNA上慢慢聚合 ◆单链DNA与其互补物在双链上快速配对反应产生异源双链连接 ◆单链从双链中慢慢转移产生一个长的异源双链DNA区带 SSB单链结合蛋白的存在刺激了这个反应 RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end RecA介导的DNA修复 重组热点 重组起始于双链破损双链破损在轴素形成期产生在联会丝复合物形成阶断消失60min 在染色体上容易发生双链破损的位点称为重组热点 Chi序列刺激它周围附近的重组 与重组有关的基因称为Rec基因 Rec突变体不能进行同源重组 大约10～20个与重组有关的DNA位点通过E coli 的Rec基因突变体鉴定 Chi序列能刺激它周围附近的重组 5GCTGGTGG 3 3CGACCACC 5 Chi序列在大肠杆菌中每510kb出现一次 Chi是一个被RecBCD基因编码的酶的作用目标 二位点专一性重组 非序列同源性 重组位点特异 由识别特异重组位点的酶指导 导致DNA序列发生重排 举例 l噬菌体插入细菌基因组 l噬菌体从细菌基因组中切离 整合过程要求在attp和attB之间进行识别而移除过程则需要在attL和attR之间进行识别 重组过程是可逆的但反应条件不同整合反应需要int产物和IHF因子移除反应还需要噬菌体xis基因产物 xis基因产物决定噬菌体是否进行复制 整合的过程 A 具有对特异性DNA强烈亲和力的Int与attP和attB位点结合 B Int的拓扑异构酶活性使两条双链各自断开一条单链瞬间旋转然后交换连接形成Holliday中间提 C 在另两条单链之间发生同样的断裂重接从而完成双链间的重组 位点专一性重组的核苷酸序列 1 attP POPO为15bp核心富含A-T的非对称序列 P为-160 O的160bp序列 P为O 80的80bp序列 共240bp 2 attB BOBB为-11 O序列 B为O 11序列 共23bp 重组后形成BOPattL91bp和POBattR171bp 特异性重组可以在体外进行 特异性重组可以通过Int和IHF在体外进行它包括在缺少任何DNA合成下的破损与再结合两个臂的功能可以通过在两侧产生缺失来研究 attp发挥作用要240bp而attB只需要由-11到11的23bp的片断即可发挥作用在这个片段中核心两侧只有4bp 通路克隆系统gateway cloning system 一种位点特异的DNA重组技术包括LR和BP两个反应体系可简单表示为 attBXattP attLXattR 用途 PCR产物的定向克隆 DNA片断高效广泛的亚克隆 氨基或羧基末端的融合蛋白表达 LR反应和BP反应 LR 反应通路克隆的主要反应LR 克隆酶整合酶 Int 和整合宿主因子 IHF 蛋白识别attL 和attR 重组位点后催化入口克隆entry clone 的外源DNA 及其两端部分位点取代目标载体destination vector 的ccdB 基因及其两端部分位点灰色 形成表达克隆expression clone BP 反应与LR 反应反向 BP 克隆酶混和物Int IHF 和切除酶Xis 催化表达载体attB 间的目的基因转到供体载体中形成新的入口克隆此克隆又可与其它目标载体重组产生新的表达载体 三转座重组 特点 1自身携带有转座酶基因末端有反向重复序列 2转座过程中出现共联体 3转座以后可以造成原来转座子位置的DNA缺失非复制转座也可以依然保持在原位而在靶序列上复制了一个转座子复制转座 4转座完成以后可以在靶序列上造成同向重复序列 5转座子插入后可影响所在位置的基因的表达 转座子 转座子指能将自身插入基因组中其它位置的一段DNA序列插入位置与转座子序列没有相关性 病毒细菌和真核细胞的质粒或基因组中都含有转座子 多数转座子在插入新位点的过程中依赖其特异的插入序列去完成 原核生物转座因子包括插入序列转座子转座噬菌体 基因组的进化既赖于获得新的序列又赖于重排目前的序列 转座子可引起其它基因组顺序的重排提供基因组里变异的主要来源重排可以产生新的序列和改变目前序列的作用 细菌噬菌体病毒尤其是逆转录病毒 可以通过传染传递遗传信息 转座子的特征性结构是它的末端