大豆1氨基环丙烷1羧酸合酶基因启动子克隆与分析.docVIP

大豆1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因启动子克隆与分析 大豆１氨基环丙烷１羧酸合酶基因启动子 克隆与分析  赵　迈　杨　君 　安利佳 大连理工大学生物科学与工程系　大连　 摘要　根据已知的大豆 １氨基环丙烷１羧酸合酶１ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ１ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ ＡＣＣ合酶基因序列ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｄｑ设计三个基因特异的反向引物 ＣＴＡ７９８ ｓｐ１ＣＴＡ７９８ｓｐ２ＣＴＡ７９８ｓｐ３分别与４个简并引物配对通过热不对称ＰＣＲｔｈｅｒｍａｌａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄＰＣＲＴＡＩＬＰＣＲ扩增获得了该基因上游约６００ｂｐ的序列利用５′ｃＤＮＡ末端快速扩 增５′ＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡＥＮＤｓ５′ＲＡＣＥ实验确定转录起始位点ＴＴＳ位于起始密码 子上游１６４ｂｐ处由此获得了大豆ＡＣＣ合酶基因上游长约３２８ｂｐ的启动子序列用ＰＬＡＣＥ和 ＰＬＡＮＴＣＡＲＥ软件分析此序列发现该序列具有启动子的基本元件ＴＡＴＡｂｏｘ和 ＣＡＡＴｂｏｘ此外 发现三个胁迫诱导元件光应答元件Ｂｏｘ１Ｂｏｘ４和诱导物应答元件Ｗｂｏｘ以ｐＢＩ１２１为基础进 一步构建了由ＡＣＣ合酶基因上游调控序列启动的ＧＵＳ基因植物表达载体通过农杆菌介导的叶 盘法转化烟草叶片瞬时表达结果表明ＧＵＳ基因在该片段的调控下获得了表达该片段具有启动 子活性 关键词　大豆　启动子　ＡＣＣ合酶　ＴＡＩＬＰＣＲ　５′ＲＡＣＥ　瞬时表达 中图分类号　Ｑ７８５ 　　启动子是基因表达调控的重要顺式作用元件在 实成 熟脱 落 等 过 程 中起 重 要 作 用 ＡＣＣ１ 某种程度上决定基因表达的时空顺序同时启动子 ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅ１ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ１氨基环丙烷 也是基因工程研究的一个重要工具因此启动子的 １羧酸合酶是乙烯合成途径中的限速酶它在植物组 〔７〕 分离及其调控机制的揭示是基因表达调控研究和构建 织内活性的大小往往决定着乙烯产生的速率 因此 基因工程表达载体的关键花椰菜花叶病毒ＣａＭＶ３５ｓ ＡＣＣ合酶基因的调控对于乙烯的体内合成是至关重要 启动子是目前植物基因工程研究中应用较广泛的组成 的大豆是一种重要的经济作物但生殖器官花和 型启动子但由于ＣａＭＶ３５ｓ启动子来自于病毒在植物 荚脱落率高达５５％～７０％研究表明大豆的落花落 基因工程应用中可能会存在一定的安全隐患因此近 荚率与温度水分光照植物体内生长素及乙烯的含 〔８〕 年来人们更倾向于分离和使用来自高等植物的启动 量等因素有关 因此对于大豆ＡＣＣ合酶基因启动子 子目前已经获得的来自高等植物的启动子包括组 的研究具有重要的现实意义目前已有报导有从番 〔９〕 〔１０〕 〔１１〕 成型启动子如水稻肌动蛋白基因启动子〔１〕玉米泛素 茄 拟南芥 以及绿豆 等植物中分离得到 ＡＣＣ 〔２〕 合酶基因启动子但有关大豆ＡＣＣ合酶基因启动子的 基因启动子 等以及组织特异型启动子如番茄果实 〔３〕 研究尚未见报道本研究分离得到了大豆ＡＣＣ合酶基 专一性启动子２Ａ１２ 大豆Ｇｍｈｓｐ１７．３２Ｂ热诱导表达 〔４〕 因启动子并对其进行初步的功