甘薯nbslrr类抗病基因同源序列的克隆及分析-cloning and analysis of homologous sequences of nbslrr disease resistance genes in sweet potato.docxVIP

摘要甘薯NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析摘要甘薯（Ipomoea.batatas）广泛分布于世界各地，是重要的粮食作物。威胁甘薯生产的主要病虫害有茎线虫病、黑斑病、青枯病和根腐病等，使用常规育种方法选育甘薯抗病品种存在着育种周期长、效率低等不足，而利用分子生物学等手段克隆出甘薯抗病基因然后基因工程方法培育抗病品种将是最有效的途径。目前尚未有克隆得到甘薯的抗病基因的报道。NBS-LRR类抗病基因是R基因中最为普遍的类群，NBS-LRR类蛋白与植物抗病反应的发生有着直接关系。NBS区具有结合ATP或GTP的磷酸的功能，LRR结构域在病原物识别方面发挥重要作用。本研究依据NBS-LRR类蛋白的P-LOOP、GLPLA两个基序设计引物，对甘薯高抗茎线虫病品种“AB94078-1”、高感线虫病品种“徐薯18”及其F1群体进行RGA分离，共获得26条新的甘薯RGA，已提交至Genbank数据库并被接受。进行氨基酸序列推导后发现，获得的RGA可分为具有TIR和no-TIR两种结构特征的NBS-LRR类抗病基因同源序列，丰富了甘薯RGA种类和数量，进一步支持了前人关于双子叶植物基因组中存在TIR和no-TIR两种结构的NBS-LRR类序列的报道，而本研究所获得的RGA也可作为克隆甘薯抗病基因的候选群体。利用DNAssistversion1.0软件对26个RGA进行氨基酸序列的推导发现，R1100-AB、R1100-16、R1100-34、R1100-79、R1100-169等5个序列除具有NBS结构域的4个保守基序外，同时其C端氨基酸序列存在LRR结构，而此前已报道的甘薯RGA均不具有LRR结构域。将本研究获得的RGA与GenBank数据库公布的甘薯NBS-LRR类RGA进行聚类分析显示，来源不同甘薯品种的RGA分属于不同的类群，新获得的RGA单独归为2大类，为R510类群和R1100类群，说明RGA也可能从另一个方面为植物种群分化提供一定的甘薯NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析佐证。随后以R510-AB为探针进行了Southern杂交，结果显示分别经不同内切酶消化的基因组杂交后均出现了多个条带，表明R510类群在基因组中存在多个拷贝。以克隆的甘薯NBS-LRR类序列上样作标准对照，与经内切酶完全消化的基因组DNA同时上样进行Southern杂交。利用Bandscan软件扫描对比杂交条带的强度，采用基因拷贝数的测定方法及公式经计算得出，在甘薯单倍体基因组中R510类群的序列拷贝数约为17，得到了R510类群在基因组中的具体拷贝数，初步推测甘薯基因组中存在多拷贝的NBS-LRR类序列。为了进一步证实NBS-LRR类序列甘薯基因组中的多拷贝存在，本研究分别根据NBS结构域第一模体P-LOOP及LRR结构域序列设计寡核苷酸探针，对甘薯基因组中NBS及LRR结构的拷贝数进行了定量检测，同时优化了利用较小片段的寡核苷酸探针进行Southern杂交的检测体系，初步得出在甘薯单倍体基因组中具有P-LOOP模体序列的拷贝数为83，具有LRR结构域的序列的拷贝数为107。结果表明，甘薯基因组中存在多个拷贝的NBS及LRR类序列，与已在其他作物中报道的NBS-LRR类RGA在基因组中以多拷贝形式存在的结果相一致。NBS及LRR结构域在基因组中以多拷贝存在，对抗病基因功能的发挥及识别多变的抗病位点具有重要意义。甘薯基因组中NBS-LRR类RGA的多重复存在，一定程度上会增大R基因的进化空间，保证了其能够产生不同功能的NBS-LRR类R基因，以抵抗不同地域环境下病原体的侵染。本研究应用寡核苷酸探针对未获得基因组全序列的甘薯基因组进行了Southern杂交，检测得到了具有NBS及LRR结构域序列的拷贝数，初步在基因组水平研究了RGA的分布情况，从而为揭示甘薯抗病分子机制及分子育种提供重要参考。此外，我们对获得的RGA进行多序列比对及同源性检索显示，R510-AB、R510-83、R510-34等序列与抗线虫病基因Mi的序列同源性较高，均达到了60％，且在某些特征性的区域几乎完全一致，提示这些RGA很有可能是抗线虫病相关序列，此结果有助于克隆获得甘薯抗茎线虫病基因全长序列，了解其序列中内含子及调控区等信息，为甘薯抗病育种奠定了基础。关键词甘薯；NBS-LRR；抗病基因同源序列；Southern杂交；拷贝数AbstractIsolationandCharacterizationofNBS-LRRtypeResistanceGeneAnalogsfromIpomoeabatatasAbstractSweetPotato(Ipomoea.batatas)wasimportantfoodcropwhichgrownwidelyaroundtheworld.