啤酒酵母蔗糖酶 提取、分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验讲解材料.ppt

啤酒酵母蔗糖酶提取、分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验;啤酒酵母;一、目的要求; 二、实验对象; 该酶以两种形式存在于酵 母细胞膜的外侧和内侧； 在细胞膜外细胞壁中的称 之为膜外蔗糖酶，其活力占总 酶活力的大部分，含有50% 糖成分的糖蛋白； 在细胞膜内侧细胞质中的称之为膜内蔗糖酶 ，含有少量的 糖。;1、蔗糖酶的提取 (细胞破壁);动物细胞;基本特征： 单细胞，椭圆形、圆形或柱形。 长5-30μm，宽1-5μm。;生物材料破碎的方法;（1） 机械（匀浆）法 ① 研钵;Teflon：聚四氟乙烯; （1）机械（匀浆）法 ③ 高速组织捣碎机（0.5-1L）、; （1）机械（匀浆）法 ④ 高压匀质机（XL）;（2）超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常选用浓度为 50-100 mg/ml菌体，在 30 至 60Hz 频率下处理 10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。;（3）反复冻融法： 将细胞在 -20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！ （4）化学处理法： 有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠 (SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。;（5）溶胞作用 (酶溶解法)： 用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。 （6）自溶法： 将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。; 自溶法破壁（本实验）;2、蔗糖酶的纯化 ;E1;1. 酶的蛋白属性； 2. 调节酶溶解度的方法； 盐析、有机溶剂分级沉淀 3. 根据酶分子大小、形状不同的分离方法； 透析、凝胶层析 4. 根据酶分子电荷性质的分离方法； 离子交换层析;1. 酶的蛋白属性 两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液 pH 条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 等电点 (isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 称为蛋白质的等电点。; 大分子(胶体) 分子量可自1 万至100 万之巨，其分子的直径可达 1～100nm，为胶粒范围之内。 稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜;+;2. 调节酶溶解度的方法；;（2）改变pH或温度； 酶在未纯化之前 pI也是未知的，pH不宜变化过大，以免失活。Cu,Zn-SOD的纯化可在 70 oC，10 min （3）改变介电常数； 有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。 亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。 亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性，导致脱水凝集。; 有机溶剂分级沉淀操作条件的控制 溶剂选择 常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。 温度 使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。 样品浓度的控制 一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5-2% 为好。;3. 根据酶分子大小、形状不同的分离方法；;（2）超滤；;中空纤维超滤装置 ;（3）凝胶层析 （gel chromatography）;凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。 在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。;34; 凝胶层析的应用范围：;凝胶层析的特点 ;4. 根据酶分子电荷性质的分离方法；;+;Sample application and wash;Elution;Regeneration;Sample applica