第七篇 章 病毒基因工程 病毒学课件.ppt

* 昆虫杆状病毒系统的应用 自1983年Smith等首次利用AcMNPV表达成功人β2干扰素以来，有近千种外源基因在该系统中得到表达，其中大部分表达产物是具较大潜力的高价值的药用物质。 AcMNPV病毒也可以将外源基因导入哺乳动物的细胞，如肝细胞——AcMNPV病毒可能成为哺乳动物基因治疗的媒介载体，因此杆状病毒有望在未来人类的基因治疗中得到应用 。 利用昆虫杆状病毒系统进行重组杆状病毒杀虫剂。 * 三、动物病毒载体 当表达高等真核基因时，应用哺乳动物表达体系比应用原核及昆虫表达体系显得更为优越，这是因为原核及昆虫细胞表达体系不能对外源真核基因产物在转录及转译后进行有效的修饰。目前较广泛地应用于哺乳动物细胞表达体系的载体有猴病毒40(simian virus40， SV40)，痘病毒(Poxvirus)，腺病毒（Adenovirus）、逆转录病毒(Retroviruses)载体等。 * SV40载体 SV40是一种能感染猿、猴等哺乳动物的DNA病毒，其基因组为环状双链DNA。 基因组在功能上分为早期转录和晚期转录两个区域。早期转录形成两种成熟的mRNA，分别编码小t抗原和大T抗原。小t抗原在病毒感染中的作用不明，大T抗原对DNA的复制起始起着十分重要的作用。 晚期转录的VP1、VP2和VP3是病毒的衣壳蛋白。 * SV40载体的构建 SV40 DNA中的非必需区很小，插入外源基因时，需除去某些区段：早期基因被置换时，不能合成T抗原；晚期基因被置换时，则不能合成衣壳蛋白——均形成所谓的缺损性病毒。 载体构建时一般在晚期转录单位中插入外源DNA，由于晚期启动子的转录水平高于早期启动子，因此外源 DNA转录的RNA和表达的蛋白量也较高。但需另一个SV40的温度敏感变异株(tsA株)作为辅助病毒提供衣壳蛋白，形成子代病毒颗粒。 早期基因被置换时，形成的重组 DNA没有T抗原，需要cos细胞来解决。 cos细胞是己被 SV40 DNA转化了的猴传代细胞，在其染色体内的SV40 DNA编码功能T抗原，但因缺乏复制起始点，病毒DNA不能复制。将重组 DNA导入cos细胞，可以形成含有重组DNA的病毒颗粒。 * 腺病毒载体 腺病毒是一类无囊膜的20面体病毒，基因组是线性双链DNA，长约36kb，两端各有一个反向未端重复区(inverted terminal repeat，ITR)，长10~162bp。 病毒DNA在细胞核中复制，但游离于染色体外。 早期转录区有E1、E2、E3和E4共4个区，编码病毒的调节蛋白；晚期转录区有L1、L2、L3、L4和L5共5个区，编码病毒的结构蛋白。非编码区含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。E3为病毒复制非必需区域。 * 第七章 病毒基因工程 主讲：马金成 生命科学学院微生物学教研室 * 第一节 病毒基因工程的主要研究内容 第二节 病毒载体的主要类型及其应用 * 第一节 病毒基因工程的主要研究内容 病毒基因工程主要研究目的就是利用重组DNA技术，高效表达病毒基因及其他外源基因或者对病毒基因组进行改造，用于制备防治病毒性疾病的疫苗、抗病毒制剂以及进行基因治疗。 * 一、病毒基因及基因组结构与功能研究 病毒基因工程技术和方法运用于病毒学研究，对于阐明病毒基因及基因组结构与功能的关系和一些病毒的基因表达调控机理有重要作用。 RNA肿瘤病毒反转录酶的发现，使中心法则得以完善及发展，同时使RNA反转录为cDNA成为实验室常规手段。 认识到有关真核基因表达调控的内在规律及原理，如基因重叠现象、转录后加工、启动子及增强子等。 * 二、病毒基因工程疫苗的研制 传统疫苗主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、类毒素等。传统灭活疫苗虽然能提供完全保护，但也会产生副作用 。 应用基因操作技术对病毒基因组进行改造，以降低其致病性并提高其免疫原性，或者将病毒基因组中的一个或多保护性抗原基因克隆到原核或真核表达载体上，制备成基因工程疫苗。 * 四、病毒载体的构建与应用 病毒载体就是利用病毒的基因组序列元件构建外源基因转移或表达的工具，多用于真核基因表达，具有以下独特的优点。 病毒基因组结构简单，易于改造和操作。 病毒增殖速度快，外源基因可高效表达。 病毒能感染特定受体细胞，使外源基因的导入效率高。 病毒具有特异的宿主范围、组织嗜性和靶向性，对基因治疗有益。 病毒的种类繁多，且各具不同的特性，构建的病毒载体也相应地具备不同的特点 。 * 高水平表达特定基因产物——疫苗研制和生产多种活性多肽。 生物杀虫剂——插入昆虫特异的毒素基因(如Bt毒素基因、神经毒素基因)、激素基因等的杆状病毒能在宿主细胞中