第二篇 章 固定化酶(1~3节) 酶工程课件.pptVIP

Enzyme Engineering酶工程;第三章 固定化酶;第一节 概述; 一. 固定化酶的发展史 固定化酶(Immobilized Enzyme）是20世纪60年代发展起来的—项新技术。以往使用的酶绝大多数是水溶性的酶。这些水溶性酶催化结束后，极难回收，因而阻碍了酶工业的进一步发展。60年代后，在酶学研究领域内涌现出固定化酶。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶柬缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用；过去曾称其为水不溶酶或固相酶。1971年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称。 从60年代起，固定化酶的研究发展很快，起初人们把注意力集中在酶的固定化方法研究上，近年来，不但固定化方法和载体开发有了长足发展，并且已转向它在工业、医药、化学分析、亲和层析、环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。 ;二. 固定化酶的概念 固定化酶是被固定在某一有限空间内不再能自由流动而仍有催化活性的酶。immobilized enzyme;第一节结束;第二节 固定化酶的性质及其影响因素; 固定化对酶活性和酶反应体系的影响是十分复杂的，常因酶的种类、反应系统的组成，特别是固定的方法及载体而显著不同。可以概括为三种类型。 1．微环境的影响 微环境是紧邻固定化酶的环境区域。微环境的影响是由于载体的亲水与疏水性质和介质的介电常数等直接影响酶的催化效应，或者是酶对效应物作出反应的能力的一种效应，通常可以通过改变载体和介质的性质作出判断和调节。;2．构象改变和屏蔽效应 构象改变是指：酶在固定化的过程中，出于酶与载休相互作用使酶的活性中心或变构中心的构象发生变化从而导致酶活性下降。这种效应难以定量描写．也难以预测。通常出现在吸附法和共价键结合法。 立体屏蔽效应是，由于载体对酶的活性中心或变构中心造成空间障碍，因而底物或效应物与酶无法接触，从而影酶的活性。若在酶和载体间加入臂，可以得到改善。;3．分配效应与扩散效应 分配效应是由于载体的亲水和疏水性质使酶的底物、产物或其他效应物在微观环境和宏观体系间发生不等分配，改变了??反应系统的组成平衡，从而影响了反应速度。作为一般规律是： (1)如果载体与底物带有相同电荷，则酶的Km值将因固定化而增大；如果带有相反电荷．则相反。 (2)当载体带正电荷时，固定化之后，酶活性一PH曲线向酸性方向偏移；相反，阴离子载体将导致该曲线向碱性方向偏移。 以上效应可通过提高介质离子强度而削弱或消除。 (3)采用疏水载体时，如底物为极性物质，或电荷物质，则酶的Km值将因固定化而降低，其他效应物亦然。 ;扩散限制效应是指：底物或其他效应物的迁移和运转受到限制的— 种效应。它分内扩散效应和外扩散效应两种。 ①外扩散限制，是指上述物质从宏观体系穿过包围在固定化酶周围近乎停滞的液膜层到固定化酶表面所受到的限制。可以充分搅拌或混合而减小或消除。 ⑦内扩散限制，是指上述物质从固定化酶颗粒表面来到颗粒内部酶活性位点受到的一种限制。 。 ;二．固定化后酶性质的变化;2． 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高 （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 (3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 (4 ) 对分解酶的稳定性提高。 （5） 对变性剂的耐受力升高;固定化后酶稳定性提高的原因：;3． pH的变化;pH对固定化酶的影响;载体带正电荷，pH向酸性方向移动。 2）产物性质对体系pH的影响 催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高；反之则低 ;4． 最适温度变化;6． 米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化;三． 评价固定化酶的指标：;三． 评价固定化酶的指标：;3. 4. 或称偶联效率，活力保留百分数。 5.相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力 ; 由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测定蛋白量较为准确。在酶固定化操作中，当酶与载体结合后，用适量适当的缓冲液淋洗固定化酶，以洗除未固定的酶，收集洗脱液，并测定其中蛋白量(或酶活力)，即为残留的蛋白量(或酶活力)。 ;四. 固定化酶的活力测定方法介绍;2. 连续测定法 固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液。根据流速和反应速度之间关系，算出酶活力（酶的形状可能影响反应速度）。 在实际应用中，固定化酶不一定在底物饱和条件下反应，故测定条件要尽可能与实际工艺相同，这样才能利于比较和评价整个工艺。