细菌遗传学与基因工程.pptxVIP

第一节 DNA的重组和重组DNA技术;Section 1  DNA recombination ;Section 1 Recombination DNA technical;一、 重组DNA技术发展史上的重大事件;年份 事 件 ;年份 事 件 ;年份 事 件 ;年份 事 件 ;二、重组DNA技术的主要内容或步骤;三、重组DNA技术的主要技术原理 ;重组DNA技术的主要技术原理 ;重组DNA技术的主要技术原理 ;重组DNA技术的主要技术原理 ;;重组DNA技术的主要技术原理 ;5．限制性酶切-“分子手术刀” restrictionendonuclease:在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。Ⅰ型：既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；Ⅱ型：只催化非甲基化的DNA的水解。 ;5. 限制性核酸内切酶——“分子手术刀” ;;6．DNA连接酶——“分子缝合针” 作用：恢复被限制酶切开了的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。 种类 ⑴ E.coli DNA连接酶：只能缝合双链DNA片段互补的黏性末端，而不能将双链DNA平末端进行连接。 ⑵ T4 DNA连接酶：既可缝合DNA片段互补的黏性末端，又可缝合双链DNA片段的平末端。但连接平末端之间的效率比较低。;6．DNA连接酶——“分子缝合针” DNA连接酶和DNA聚合酶的比较:;7．基因的载体——“分子运输车” 作用：是基因运输的工具:一是用它作为运载工具，将目的基因送到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。 条件 ①能在宿主细胞内稳定保存并大量复制； ②有一个至多个限制酶切点，以便与外源基因连接； ③具有某些标记基因，以便进行筛选。;7．基因的载体——“分子运输车” 种类： 目前，基因工程经常使用的载体主要有以下几类： ⑴ 细菌的质粒：最常用的载体。 ⑵噬菌体 ⑶动植物病毒 它们来源不同，在大小、结构、复制以及插入片段大小上也有很大差别;8．细菌的转化 一细菌菌株捕获另一细菌菌株的DNA，导致性状特征发生遗传改变 供体菌株 –受体菌株 大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株 CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells） 每μg DNA可得107-108个转化子 ;小结;第二节重组DNA技术的基本操作程序;第二节重组DNA技术的基本操作程序;第二节重组DNA技术的基本操作程序;第二节重组DNA技术的基本操作程序;第二节重组DNA技术???基本操作程序;第二节重组DNA技术的基本操作程序;第二节重组DNA技术的基本操作程序;;第三节 转座因子（transposable element） ;第三节 转座因子（transposable element）;原核生物中的三类转位因子： Three principle classes of TE 1. Insertion sequence（IS,插入序列） 2. transposon Tn （ 转座子 ） 3. 转座噬菌体;插入序列（insertion sequence IS）： 最小\最简单的转位因子，2kb 两端具有短的末端反向重复序列(inverted terminal repeats) 只编码参与转座作用的转座酶（transposase） 不携带任何已知与插入功能无关的基因区域 插入后与插入位点附近的序列共同起作用。;;转座子（transposon Tn）： 一般2kb，除携带与转位有关的序列外，还带有某些结构基因 因此当Tn插入某一基因时，可引起细菌性状的变化。 转座噬菌体：是一些具有转座功能的溶原性噬菌体。 ;Transposon;转座子的种类与特征;第四节 文库构建与酵母双杂;基因组文库的构建 ;用HacⅢ-Alul双酶消化法;基因组文库技术(引自Griffiths et al.1996) ;cDNA文库的构建 ;cDNA文库构建(引自Old Primrose,1980) ;酵母双杂交体系 ;总RNA提取、纯化--mRNA分离--高丰度mRNA差异消减--cDNA制备--cDNA连接AD载体--连接产物转化大肠杆菌--cDNA文库效价测定--cDNA文库扩增等 ;酵母双杂交体系 ;酵母双杂交文库的利用;;谢谢！