东海区野生优质鱼种质细胞超低温冷冻保存技术研究.pdfVIP

分类号—— 密级—— UDC一 编号—— 浙江大学普陀海洋高科技园区 博士后研究工作报告 东海区野生优质鱼种质细胞超低温 冷冻保存技术的研究 王 阳 光 工作完成日期： 2QQ5：lQ 提交报告日期； 2QQ互：jl 东海区野生优质鱼种质细胞超低温冷冻保存技术的研究 摘 要 鱼类精子超低温冷冻保存研究己经在上百种鱼获得成功。但是，在数万 种鱼当中，这只是其中极小的一部分。另外，目前鱼类精子冷冻保存所报道 的方式方法多种多样，迫切需要建立比较规范的、相对统一的技术路线。本 文对失黄鱼和鲈鱼精子的生理特性及其冷冻保存技术进行了系统的研究，得 到了在液氮f—l 96℃)条件下的适宜保存条件，建立了其精予超低温冷冻保存 的简便易行、效果优良、便于实际应用的技术方案。 x1 大黄鱼精液的DH值为7左右，精子密度为2．220“。个／Ⅲ1。在4℃下， 精子离体3h后还有85％活力，而在25℃下，】h后只有70％。在精子激活液 中，不同的盐度和pH值时精子妁活力乖寿命影响：糖子在pH为4一lo都有活 力，最适宜的p{{值为7，精子被激活最适宜盐度为3％。在各种不同配方中， 释液配方对精子的冷冻保存效果较佳，精子激烈运动活力达到90％左右，精液 5％^FGP和l0％丙三醇的效果好， 与营齐稀释液适宜比例为1：3；抗冻剂以l 4 s、 精子的活力都达到90％左右，激烈运动时间和寿命最长，分别为505±4 690±29 5 s、630±4l s和485±4 s，但经过半年保存之后，l5％AFGP的好 于1O％丙三醇的，仍有90％活力左右，而乙二醇、丙二醇和二甲亚砜对精子保 5 min， 存效果则差。冻存方法采用先在一40℃先平衡1min，置于液氮上空3 mi 再浸入液氮为好；解冻采用室温自然方法，并且在3 n内完成酌工艺较好。 明显低于其它两者，表明精子受到损伤。通过电镜观察，不添加抗冻剂的精 命影响：精子在邮为4—1 适宜盐度为3％。以2号(c()rtj 精子的冷冻保存效果较佳，精子激烈运动活力达到85％左右，精液与营养稀释 液适宜比例为1：3；抗冻剂以l5％乙二醇的效果好，精子的活力都达到85％ 75±42 5±39 左右，激烈运动时间和寿命最长，分别为4 s和61 s；而丙三醇 5％。采用先在一2o℃先平 和AFGP对精子保存效果则很差，精子活力都不超过6 5 mi 衡1 n，置于液氮上空3min，再浸入液氮的冻存方法和室温解冻，并且 在3min内完成的工艺较好。 在大黄鱼胚胎冷冻方面，逐个筛选了方案中各个因素的最佳水平。首先 研究营养稀释液配方对·心跳期胚胎在一30℃低温保存的影响，以2号 ((：ortl andsJ营养稀释液的冷冻保存效果较好，孵化率为68．4％±6．2％，其 sever 次为1(Al s)号，效果最差 s 为3号(stos＆Holtz’s)，孵化率仅为23．4％±1