VEGFA及其受体VEGFR与子宫内膜癌生物学行为关系的探讨.docVIP

　　VEGFA及其受体VEGFR1与子宫内膜癌生物学行为关系的探讨 【摘要】 目的：检测50例子宫内膜癌组织及癌旁正常内膜组织的VEGFA和VEGFR1的表达情况，探讨VEGFA及其受体VEGFR1是否与子宫内膜癌的侵袭与转移有关。方法： 采用RTPCR技术对50例癌组织及癌旁正常组织进行VEGFA和VEGFR1 mRNA 半定量检测；采用MIV逆转录酶及Taq DNA聚合酶均购自上海生物工程公司。 1．3．3 RTPCR 逆转录反应体系为30 μl，RNA模板量为10 μg，采用随机引物法将RNA逆转录为cDNA，在PTC200PCR扩增仪上扩增。总反应体积为50 μl，每管加10 mmol·L-1 VEGFA或VEGFR1上下游引物各1 μl，10 mmol·L-1βactin上下游引物各1 μl，10×PCR缓冲液5 μl，15 mol·L-1MgCl2 4 μl，TaqDNA酶0.4 μl，加水至50 μl。VEGFA反应条件为：94 变性1 min；56 退火1 min，72 延伸1 min，30个循环；复性5 min。VEGFR1反应条件为：94 变性1 min；62 退火2 min，72 延伸3 min，35个循环；复性5 min。 1．3．4 PCR产物测定 取10 μl PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳（120 V）30 min，在紫外灯下观察扩增的特异条带，凝胶图像分析系统扫描各电泳带的灰度值，计算VEGFA和VEGFR1与βactin的灰度值的比值。 1．4 in，取其上清液，各标本取50 μl测蛋白浓度（Brandford法），调整各标本蛋白质量浓度为2 mg·L-1。取调整浓度后的组织细胞裂解液10 μl加入等体积2×电泳加样缓冲液，均匀后置95 水中加热10 min。采用的分离胶浓度为12%，积层胶浓度为5%，在装置（Hoefer Pharmacia Biotech Inc，USA，型号为miniVE Complete，美国）上电泳，积层胶电压为80 V，分离胶电压为120 V；电泳结束后转膜，转膜装置（BioRad公司，型号miniprotein Ⅱ cell，美国）设电压90 V、电流200 mA。转膜后的硝酸纤维素膜在封闭液中温和震荡1 h，再把膜放入1250的稀释一抗中，4 过液，用TBST液洗膜3次，把膜置于12 000稀释的二抗中温和震荡1 h，在TBST中洗膜3次，在暗室中膜上加入ECL液4 ml，曝光、显影、定影。图像分析系统扫描各X片条带的灰度值，计算VEGFA和VEGFR1与βactin的灰度值的比值,即为癌组织和正常内膜组织的蛋白质表达水平。2 结 果 2．1 子宫内膜癌及癌旁正常子宫内膜VEGFA和VEGFR1的表达 结果见表1和图1。 2.2 子宫内膜癌VEGFA和VEGFR1的表达与组织病理学关系 结果见表2、3。癌旁及深肌层组VEGFA在mRNA及蛋白质的表达明显高于浅肌层侵袭组（P＜0.05）；G3明显高于G1、G2（P＜0.05）。淋巴结转移组在mRNA及蛋白质的表达与淋巴结未转移组无显著差异（Pgt;0.05）。宫旁及深肌层组VEGFR1在mRNA及蛋白质的表达明显高于浅肌层侵袭组（P＜0.05；G3与G1、G2在mRNA及蛋白质的表达无差异（Pgt;0.05）。淋巴结转移组在mRNA及蛋白质的表达与淋巴结未转移组无显著差异（Pgt;0.05）。表1子宫内膜癌及癌旁正常子宫内膜 3 讨 论 3.1 VEGFA及其受体VEGFR1的分泌及作用机制 VEGFA是由肿瘤细胞及炎症浸润细胞所分泌［1］。它通过其受体VEGFR1及VEGFR2引起血管生成［2］。VEGFR1在血管内皮细胞上表达，也可在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、外周细胞和胎盘的滋养细胞中表达[3]。Laxmanan等[4]研究发现VEGFA可通过树突状细胞上的VEGFR1改变树突状细胞的功能，从而使机体对肿瘤细胞的免疫抵抗力下降，肿瘤细胞易于转移和扩散。Yokoyama等［5］通过对86例子宫内膜癌组织进行免疫组化研究发现，VEGFA及其受体在子宫内膜癌细胞浆表达。VEGFR1和VEGFR2在癌组织中也可在血管内皮细胞上表达。通过自分泌和旁分泌调节肿瘤血管的生成，促进肿瘤细胞的增殖。本研究结果显示，与癌旁正常子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织VEGFA和VEGFR1的表达明显增高；表明子宫内膜癌组织分泌VEGFA和VEGFR1。表2 子宫内膜癌VEGFA的表达与手术病理分期的关系表3 子宫内膜癌VEGF1的表达与手术病理分期的关系 3．2 VEGFA及其受体VEGFR1在子宫内膜癌侵袭与转移的作用 本研究结果显示，癌组织VEGFA和VEGFR1的表达明显高于正常内膜组织，深肌层