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导入细胞凋亡抑制基因 用基因工程方法将bcl-2基因这种细胞凋亡抑制基因导入细胞。Bcl-2基因的过量表达能抑制细胞凋亡，提高细胞密度和目的蛋白产量。 第63页/共70页 Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺 DMEM培养基 胎牛血清 其他成分 锥形瓶逐级放大培养 加碱（碳酸氢钠） 加糖（葡萄糖） 灌注培养液 微载体 5L种子罐培养 培养液 50L 生 物 反 应 器 接种狂犬 病毒 出液口 收获病毒 第64页/共70页 三 动物细胞的低温保存 （一）非玻璃化冻存 1、原理：冰晶损伤和溶质损伤，缓慢冷冻和快速复苏以及冷冻保护剂的作用（降低细胞内的冰点，提高细胞膜对水的通透性，稀释细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而减少溶质损伤） 2、冻存方法 （1）冷冻步骤：旺盛生长的细胞（冻前24小时更换培养液） 制备单细胞悬浮液 将甘油或二甲亚砜以5%的终浓度加到培养液中，制备冻存液 冻存液悬浮细胞 4 ℃放置30~60min 冻存管于-70 ℃冰箱中放置1~2d 液氮保存 （2）复苏步骤：液氮 37~40 ℃水浴（40~60s） 3、影响细胞冻存的因素：冻存温度（液氮-196 ℃，干冰-79 ℃）、冷冻速度、融冻速度及冷冻保护剂 第65页/共70页 -196℃液氮罐 普通冰箱 低温冰箱 第66页/共70页 （二）玻璃化冻存 1、玻璃化冻存的原理： （1）玻璃化：指液体转变为非晶态的固化过程 （2）研究核心：寻求容易实现玻璃化并且对细胞损害较小的溶液，并设法提高冷冻速度 2、玻璃化冷冻保护液：40~60%（W/V）高浓度 3、冻存方法 （1）冷冻步骤：制备冻存液（Hanks平衡盐溶液中加20.5%DMSO,15.5%乙酰胺,10%丙二醇和10%聚乙二醇，pH7.4)并冰浴 离心制备待冻存细胞 缓慢加冻存液(0.3ml/min 3min,0.6ml/min 5min,0.75ml/min) 混匀 液氮保存 （2）复苏过程：冰浴5min融冻 用含20%血清的Hanks平衡盐溶液稀释冻存悬液（50ml稀释液滴加65min） 低速离心回收细胞 第67页/共70页 -196℃液氮罐 第68页/共70页 补充文献： 课后视频： /v_show/id_XNzA0NTc1NzI=.html 第69页/共70页 下节内容 动物细胞培养生物制药的应用 预习文献资料 第70页/共70页 (四)动物细胞大规模培养的方法 动物细胞培养的方法 根据培养细胞的种类：原代细胞培养和传代细胞培养 根据培养基的不同：液体培养和固体培养。 根据培养容器和方式的不同：静止培养、旋转培养、搅拌培 养、微载体培养、中空纤维培养、固定床或流化床培养等。 从生产实际看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培 养、贴壁培养和贴壁—悬浮培养。 第31页/共70页 1、悬浮培养 所谓悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。它适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。 该培养方法的优点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备的设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验。 不足之处细胞密度一般较低。目前在生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌罐式生物反应器和气升式生物反应器。 第32页/共70页 2、贴壁培养 贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培养方法。它适用于一切贴附依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。 该方法的优缺点与悬浮培养正好相反，优点是适用的细胞种类广（因为生产中所使用的细胞绝大多数是贴壁细胞），较容易采用灌注培养的方式使细胞达到高密度； 不足之处是操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差，另一种被普遍采用的贴壁培养方法是固定床式生物反应器，但由于该反应器中传质和传氧常会出现梯度式不均一现象，故放大常受到限制。 第33页/共70页 3、贴壁－悬浮培养 或称假悬浮培养，悬浮培养和贴壁培养都有一定的优点和不足，那么能否将两者结合，优势互补，形成一种更理想的、更适于工业化大规模生产的培养方法呢？下面将介绍几种主要的使两者结合的培养方法 第34页/共70页 2.微载体培养技术 微载体（Microcarrier）：是直径60-250μm的适用于贴壁依赖型细胞生长的微粒。 一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成。 第35页/共70页 1967年，维茨尔（Van Wezel）开发了微载体系统。 微载体系统将传统的一维平面贴附扩展为三维立体贴附，摆脱了传统的培养瓶（管）培养限制。同时