分子生物学研究方法2.pptxVIP

DNA重组的一般步骤1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。重组DNA实验中常见的主要工具酶酶?????? 类功????? 能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5到3方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH末端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接末端转移酶在双链核酸的3末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶III从DNA链的3末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5或3末端的磷酸基团（一）特点 1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2.?至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3.?至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞 4. 安全性一、载体基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞自主复制的DNA分子。（二）类型1、质粒载体常用的克隆载体、双链环状的DNA分子（也有线性的）、能独立地自我复制及转录。作为克隆载体的质粒应具备以下特点:①分子量小，稳定存在，较高拷贝数；②遗传标志；③内切酶点。123（1）pBR322质粒载体来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tertr）来源于pSF2124质粒转座子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（ampr）来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）（2）pUC质粒载体位于lacZ基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点(MCS)区段，它并不破坏该基因的功能。大肠杆菌β-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码α-肽链的DNA序列氨苄青霉素抗性基因(ampr)，来自pBR322质粒的复制起点（ori）（3）pGEM-3Z质粒 2、噬菌体（1）噬菌体的生物学特性溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。(烈性噬菌体只具有溶菌生长周期)溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。(温和噬菌体具有溶源生长周期和溶菌生长周期)（2）λ噬菌体A. 生物学特性 组成：蛋白质外壳和线状双链DNA分子组成。 ?DNA长度为48502bp，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点（cohesive end site）。 温和噬菌体一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。 复制溶源周期随溶源细菌染色体一起复制溶菌周期的早期是“θ”复制，晚期进行滚环复制 基因组成?DNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3为非必须区段。 B. 类型插入型 （Insertion vectors ）这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。如：λgt10 、 λgt11 克隆能力小，不到10kb置换型 （Replacement vectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的λDNA区段是λ噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon 4 载体克隆能力大，20～25kb（3）M13噬茵体生物学特性单链闭合环状噬菌体只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约6.4kb，可分为10个区和507 bp基因间隔区（IS区），该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。复制与增殖进入细胞内部的M13（＋）链DNA，便起到一种模板的作用，合成出互补的（一）链 DNA。由此形成的双链形式的M13DNA，称为复制型 DNA。它按θ形式进行几轮复制之后，基因 Ⅱ的产物便在RFDNA的正链待定位点上作切割反应，形成一个缺口。这样，M13基因组的扩增活动便正式开始启动。其基本特点是利用大肠杆菌的DNA聚合酶I，以环形的MI3（一）DNA为模板合成 M13（＋）DNA。当DNA复制叉沿着模板DNA分子转移到复制终点时，在基