pdl1分子在肿瘤相关巨噬细胞介导肺癌免疫逃逸中作用-role of pdl 1 molecule in tumor-related macrophage-mediated immune escape from lung cancer.docxVIP

PD- PD-L1 分子在肿瘤相关巨噬细胞介导肺癌免疫逃逸中的作用 中文摘要 PAGE PAGE VII PAGE PAGE VI PD-L1 分子在肿瘤相关巨噬细胞介导 肺癌免疫逃逸中的作用 中文摘要 近年来肿瘤免疫治疗研究突飞猛进：机体免疫系统具有免疫监视清除肿瘤细胞的 作用，在肿瘤的发生、发展及转移过程中扮演极其重要的角色。而肿瘤的免疫治疗与 肿瘤微环境密切相关，肿瘤微环境由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管以及肿瘤浸润 细胞，如树突状细胞、巨噬细胞等共同构成。作为肿瘤免疫发生的场所，肿瘤微环境 中存在众多与肿瘤免疫相关的因素，包括细胞因子的负性调节作用，抑制性免疫调节 细胞 Treg、抑制性配体受体反应以及肿瘤微环境 T 细胞代谢活性的负调节等。研究 显示，负性协同刺激分子 PD-L1 是近年来备受关注的免疫分子，PD-1/PD-L1 信号通 路激活可抑制肿瘤局部微环境 CD4+ T、CD8+ T 细胞的增殖和活化，免疫效应降低， 从而介导肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤生长。本文着重分析了 PD-L1 分子在肿瘤微环境 中相关免疫细胞、肿瘤细胞上的表达，探讨其调节机制和生物学意义，为研究其介导 肺癌免疫逃逸的机制提供新的证据。 一、PD-L1 分子在肿瘤相关巨噬细胞上的表达 【目的】探讨恶性胸水中肿瘤相关巨噬细胞上 PD-L1 的表达及其临床意义。 【方法】收集苏州大学附属第一医院呼吸科 2013 年 10 月到 2014 年 10 月期间收 治的 76 例胸水患者临床资料。肺癌组 52 例，其中腺癌 32 例，鳞癌 20 例，另取结核 性胸膜炎组 24 例作为研究对照组。收集胸水，采用 ficoll 密度梯度离心法获取胸水单 个核细胞（PEMC），流式细胞术检测 PEMC 细胞表面肿瘤相关巨噬细胞上 PD-L1、 B7-H4 的表达。 【结果 】肺癌 恶性 胸 水与结 核性 胸水相 比 ， PEMC 细胞 表面 CD68+PD-L1+ （30.16±16.64%vs 14.09±11.89，P＜0.01）、CD68+B7-H4（+ 16.97±10.32%vs 7.17±5.52%， P＜0.01）细胞及 CD68+B7-H4+PD-L1+比例较高（11.05±9.51% vs 3.99±5.03%,P＜ 0.01 ）。 在 肺 鳞 癌 和 腺 癌 中 ， PEMC 细 胞 中 上述三种 细胞 群体 CD68+PD-L1+ 中文摘要 PD-L1 分子在肿瘤相关巨噬细胞介导肺癌免疫逃逸中的作用 （ 28.73±15.03%vs 32.44±19.13 ， P=0.440 ）、 CD68+B7-H4+ （ 17.83±10.73% vs 16.58±12.35% ， P=0.701 ） 及 CD68+B7-H4+PD-L1+ （ 10.06±7.43% vs 12.63±12.17 %,P=0.348）比例未见差异（P 值均大于 0.05）。 【 小结 】 肺 癌 恶 性 胸 水 PEMC 细 胞 中 CD68+PD-L1+ 、 CD68+B7-H4+ 、 CD68+B7-H4+PD-L1+细胞比例均明显高于结核性胸膜炎组，对鉴别肺癌恶性胸水及结 核性胸水具有一定的应用价值。 二、肿瘤相关巨噬细胞对肺癌细胞上 PD-L1 分子表达的调节及其生 物学意义 【目的】研究肿瘤相关巨噬细胞对肺癌细胞膜表面 PD-L1 分子表达的调节作用， 并探讨其生物学意义。 【方法】（1）采用恶性胸水及胸水中肿瘤相关巨噬细胞培养上清（TAMs 上清） 培养肺癌细胞（A549 细胞），流式细胞术检测 A549 细胞膜表面 PD-L1 表达，Transwell 小室检测 A549 细胞侵袭能力的改变。（2）收集恶性胸水，采用 ficoll 密度梯度离心 法获取胸水 PEMC，流式细胞术检测 PEMC 细胞群中 TAMs 细胞内 IL-6、IL-10、TNF-α 以及 INF-γ 的表达。（3）采用 IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ 刺激 A549 细胞后，流式 细胞术检测 A549 细胞膜表面 PD-L1 表达。（4）应用 Western blot 法检测 IFN-γ 刺激 A549 细胞后 p-ERK、p-AKT 以及 p-Stat3 的表达变化。（5）抑制 ERK、 AKT、Stat3 信号途径，予 IFN- γ 刺激 72h，检测 A549 细胞膜表面 PD-L1 的表达水平变化。（6） 加入 PD-1 融合蛋白与 IFN-γ 诱导的 A549 细胞膜膜表面 PD-L1 分子发生配基化，采 用 CCK-8 法检测细胞的增殖、流式细胞术检测细胞凋亡的改变以及 Transwell 小室检 测细胞侵袭能力的变化。（7