pkc和rab gtpase在钙信号调节骨骼肌细胞glut4胞内运输机制中的作用-roles of pkc and rab gt pase in calcium signal regulation of glut 4 intracellular transport mechanism in skeletal muscle cells.docxVIP

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√” ）学位论文作者签名：日期：年月日 导师签名 ：日期：年月日目的：中文摘要应用稳定过表达 GLUT4myc 的 L6-GLUT4myc 大鼠骨骼肌细胞探讨传统型 PKC（conventional PKC，cPKC）、新颖型 PKC（novel PKC，nPKC）以及 Rab 蛋白在钙信号调节骨骼肌细胞葡萄糖转运子 4（glucose transporter 4，GLUT4） 胞内运输机制中的作用。方法：第一部分，用 1?M 钙离子载体 ionomycin 孵育 L6-GLUT4myc 成肌细胞， Western blot 检测 ionomycin 对 PKC 底物磷酸化的影响，并用 1?M cPKC 和 nPKC 抑制剂 G?6983 和 1?M cPKC 抑制剂 G?6976 预孵育 L6-GLUT4myc 成肌细胞， ELISA 测定细胞表面 GLUT4 水平及 GLUT4 的内吞和外排，Western blot 检测 PKC 底物的磷酸化，探讨 cPKC 和 nPKC 是否参与 ionomycin 促进骨骼肌细胞 GLUT4 转位的作用。第二部分，应用 RNA 干扰技术分别下调 PKCα、PKCζ 和 PKCε 的蛋白表达， 随机分为对照组和 ionomycin 组，ELISA 测定 ionomycin 作用下的 GLUT4 转位 以及 GLUT4 的内吞和外排，进一步探讨何种 PKC 亚型参与 ionomycin 促进骨骼 肌细胞 GLUT4 转位的作用。第三部分，应用 RNA 干扰技术分别下调 Rab8a、Rab13 和 Rab14 的蛋白表 达，随机分为对照组和 ionomycin 组，ELISA 测定细胞表面 GLUT4 水平，探讨 哪个 Rab 参与 ionomycin 促进骨骼肌细胞 GLUT4 转位的作用。结果：我们前期的研究结果显示：ionomycin 升高 L6-GLUT4myc 成肌细胞胞浆 Ca2+浓度，显著增加细胞表面 GLUT4 水平。第一部分结果显示：ionomycin 显著增加 PKC 底物的磷酸化水平。G?6983 和 G?6976 均显著抑制 ionomycin 促进的 GLUT4myc 转位（p0.05，p0.001）和 PKC 底物的磷酸化。Ionomycin 抑制 GLUT4myc 内吞，促进 GLUT4myc 外排， G?6983 既抑制 ionomycin 抑制的 GLUT4myc 内吞（p0.01）也抑制 ionomycin 刺激的 GLUT4myc 外排（p0.001）。G?6976 抑制 ionomycin 抑制的 GLUT4myc 的内吞（p0.05）但不影响 ionomycin 促进的 GLUT4myc 的外排。第二部分结果显示：siPKCα 和 siPKCζ 均显著抑制 ionomycin 刺激的IGLUT4myc 转位（p0.001），而 siPKCε 不影响 ionomycin 促进的 GLUT4myc 转位。siPKCζ 既抑制 ionomycin 抑制的 GLUT4myc 内吞（p0.001）也抑制 ionomycin 促进的 GLUT4myc 外排（p0.001）。siPKCα 抑制 ionomycin 抑制的 GLUT4myc 的内吞（p0.001），但不影响 ionomycin 促进的 GLUT4myc 的外排。第三部分结果显示：siRab13 显著抑制 ionomycin 促进的 GLUT4myc 转位（p0.05），而 siRab8a 和 siRab14 不影响 ionomycin 刺激的 GLUT4myc 转位。 结论：Ionomycin 激活骨骼肌细胞 PKC。cPKC 和 nPKC 参与 ionomycin 促进 GLUT4 转位的作用，PKCα 和 PKCζ 是 起作用的 PKC 亚型。cPKC 介导 ionomycin 抑制 GLUT4 内吞的作用，PKCα 是起作用的 cPKC 亚