重组人促红细胞生成素纯化.pptVIP

洗脱剂的选择？ EPO疏水性较强，仅使用乙醇溶剂洗脱效果不理想 添加蛋白促溶剂盐酸胍以增强乙醇的洗脱能力，可将样品浓缩至96.7%，并可去掉80%左右的杂质——大规模生产的可能性 为什么采用无FBS的生产培养基？ 牛血清白蛋白的等电点与EPO极为相近，利用阴离子交换色谱柱很难将其分开。 无FBS的培养基可以排除牛血清白蛋白对纯化的干扰，显著提高了两种色谱柱的上样量。 最后一步分子筛色谱的作用？ 将培养上清中一部分与rHuEPO疏水性，等电点极为接近的蛋白质尽量去除，得到98%以上纯度的产品。 而且使用可以用于临床的柠檬酸缓冲液做流动相，不需另作临床使用溶剂置换处理。 关于三步法的缺点 反相作为起始步骤？ 反相色谱是以高分辨率的纯化方法，将其作为起始步骤，不能及时处理大量样品，而且起始物质成分复杂，可能并不能达到良好的分离效果，还有可能会影响反相介质的再生作用。 关于EPO纯化方法的延伸 沉淀方法： 酒精沉淀（浓度达90%），硫酸铵沉淀（uEPO），醋酸沉淀（活性丧失） 要求：样品体积小，蛋白浓度高 亲和层析： EPO抗体包括合成多肽抗体- ，uEPO和rhEPO抗体，将抗体交联于Affi-Gel或Sephadx等基质制成免疫吸附柱可用于EPO纯化 要求：亲和层析的洗脱液往往高盐并加有疏水剂，须脱盐，脱疏水剂。 影响纯化的因素 纯化的注意点——目的蛋白的回收及活性回收——这是评价纯化方法优劣的一项重要指标，使EPO稳定与否的基础。 EPO分子糖基很大，脱糖基EPO在体外人有很强的生物活性，但在体内却无活性。寡糖链上的唾液酸与体内活性密切相关，除去末端唾液酸后体内活性丧失。 EPO的糖链对其在溶液中的稳定性也至关重要，有报道说脱糖基化及脱唾液酸化EPO易于聚集。 因此，造成脱糖基化和脱唾液酸化的纯化方法和步骤均会影响EPO的体内活性和活性回收率。 为此纯化过程中须抑制造成水解蛋白，脱糖基，唾液酸化的酶类，如加入一定浓度的苯基对氨基水杨酸，适当浓度的盐，尿素，葡糖胺等。 EPO链内二硫键的保持对稳定性非常重要，为此有人在溶液中加入氧化剂CuSO4或巯基保护剂二硫苏糖醇予以保护。同时在洗脱过程中避免强烈的洗脱条件以防肽链或二硫键断裂以及蛋白构象改变等从而引起蛋白质变性。 临床使用Epo必须避免聚合体形式，预料共价聚集将其较低活性并可能产生新的抗原性。 在50℃加热条件下观察EPO聚集情况发现，在酸性环境中形成非共价多聚体，但在碱性环境时共价键形成，盐浓度增加则增加聚合，脱糖基化显著使其对热聚合敏感。 参考文献 用三步法纯化重组人促红细胞生成素 李琳 邓继先 生物技术通讯1997年第8卷第1期 促红细胞生成素的纯化 李琳 邓继先 生物技术通讯1996年第7卷第2期 重组人促红细胞生成素纯化工艺 黄伟东 中国生物制品学杂志2002年第15卷第4期 重组人促红细胞生成素纯化工艺的优化 李干祥 生命科学研究2001年6月第5卷第2期 重组人促红细胞生成素生产工艺研究 朱绿松 药物研究2001年第10卷第4期 Purification of Erythropoietin E. GOLDWASSER AND C. K.-H. KUNG Proc. Nat. Acad. Sci. USA Vol. 68, No. 4, pp. 697-698, April 1971 反相高效液相色谱法分离重组促红细胞生成素 邹钟诚 孙开来 色谱1998年5月第14卷第3期 Thank You ！ * 圆二色谱表明人红细胞生成素的肽链骨架50％为α-螺旋，其余为无规则卷曲结构，其中两个反平行的α-螺旋组成类似于生长激素的结构。 红细胞生成素分子中糖键结构也已明确。126位O糖链的主要组成为N-NeuNAC α-2→3Gal β1→3 (NeuNAC α-6) Gal NAcOH－丝氨酸。 糖基化红细胞生成素对热和pH变化稳定，等电点为4.2～4.6，未经糖基化肽链等电点pH为9.2。 * CHO EPOC2细胞在含5％FBS的DMEM 培养基中培养生产，2 L滚瓶中培养生产72～ 96 h后，细胞基本生长成单层，接种堆积床 生物反应器，经6～7 d的培养后，细胞密度 可达1×10 7 ／ml以上，改换无血清培养基进行 生产培养收集培养上清经体内活性测定为 2 000～3 000 u／mI 培养上清贮存于4℃待 纯化． 重组人促红细胞生成素的纯化 什么是促红细胞生成素？ 促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一种促进红系造血前体细胞分化，繁殖的细胞因子。 EPO产生于人的肾及胎儿的肝脏。 EPO的研究历史 1977年 Miyake 等人首先经过7