免疫细胞培养流程20180528.pptxVIP

免疫细胞生产流程 细胞生产流程 1 细胞采集 2 细胞分离 3 细胞培养 4 细胞质检 5 细胞收获 除细胞采集外，所有操作均在符合GMP标准的洁净环境下操作。 细胞生产流程 1.细胞采集 机采（单采） 血细胞分离机采集PBMC达到109数量级，细胞数量多，培养周期短。对患者（顾客）身体要求高。 手采 采集患者外周血50-200ml，PBMC达到108数量级，细胞数量较少，培养周期略长。 细胞生产流程 2.细胞分离 PBMC PBMC即peripheral blood mononuclear cell，外周血单个核细胞。外周血各种血细胞的密度不同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞分离。 细胞生产流程 2.细胞分离 血液收集 生物安全柜紫外照射30min，开机运行至少5min； 镊子夹取酒精棉球； 酒精棉球擦拭手术剪及止血钳“头部”，单向擦拭； 夹取新的酒精棉球擦拭血袋管路； 止血钳夹住血袋管路，手术剪剪掉血袋管路前段，利用重力，使血液通过管路收集至离心管中。 细胞生产流程 2.细胞分离 密度梯度离心 新鲜抗凝血与生理盐水1:1 混匀后，小心滴加于淋巴细胞分离液之液面上。离心机升速降速都设置为低档。离心。 细胞生产流程 2.细胞分离 密度梯度离心 细胞收集： 吸取白膜层，离心洗涤。细胞培养基（1640）或其他缓冲溶液洗涤两次收集PBMC。 细胞生产流程 2.细胞分离 注意事项 血液、分离液及环境温度在20~25℃之间，分离效果较好； 抗凝血稀释时要去除抗凝剂体积； 吸取PBMC时不可避免会吸取部分分离液，要足够稀释，才可以把PBMC离心下来； 离心时，升降加速度要调到足够低档； 严格无菌操作。 细胞生产流程 3.细胞培养 一般，PBMC收集约1x106/ml外周血（因人而异）； 计数； 根据计数结果，收集到的PBMC，用初始培养基重悬，按1~3x106/ml的密度接种于初始培养容器（培养瓶或培养袋）； 置于5% CO2 、37℃的 二氧化碳培养箱中培养，定期显微镜观察细胞，计数，依据细胞生长状况补加扩增培养基。 初始培养基及扩增培养基或者相关细胞因子添加依据培养目的配制或添加。 细胞生产流程 3.细胞培养 一般，PBMC收集约1x106/ml外周血（因人而异）； 计数； 根据计数结果，收集到的PBMC，用初始培养基重悬，按1~3x106/ml的密度接种于初始培养容器（培养瓶或培养袋）； 置于5% CO2 、37℃的 二氧化碳培养箱中培养，定期显微镜观察细胞，计数，依据细胞生长状况补加扩增培养基。 初始培养基及扩增培养基或者相关细胞因子添加依据培养目的配制或添加。 细胞生产流程 3.细胞培养 培养过程中，显微镜观察： 细胞生产流程 4.细胞质检 细胞收获前48小时取样检测。 计数、细胞活率检测； 内毒素检测； 细菌、真菌检验； 支原体检测； 流式表型检测； 细胞杀伤检测。 根据不同的培养目标制定相关的质检合格标准。 细胞生产流程 5.细胞收获 收集细胞培养液； 移入250ml一次性离心管，离心，收集沉淀的细胞，轻轻打散。 移至50ml一次性离心管，离心，收集沉淀的细胞，轻轻打散。 重复步骤。 细胞加入生理盐水，混匀。 取样，计数、检验、留样。