微生物--土壤放线菌的分离与鉴定..docxVIP

土壤放线菌的分离与鉴定实验设计报告学 院： 生命科学学院班 级： 2013级生科2班 组 长：刘 瑜 2013506076组 员：汤界世 2013506070 李宇秀 2013506071 于淑婷 2013506075 陈洁作 2013506079 郑国梁 2013506083 2015年10月15日实验目的1、了解采集土样的要求和方法。2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。4、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。实验原理土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特殊培养基的方法，来获得放线菌。放线菌菌丝由基内菌丝，气生菌丝和孢子丝组成。其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。基内菌丝体大部分呈黄、橙、蓝、紫、绿、徽，但也有无色在显微镜下观察时，气生菌丝体颜色较深，且较基内菌丝体粗两倍左右。气生菌丝体发育到一定阶段，在它上面形成孢子丝。孢子丝形状有直、波曲、螺旋、轮生之分。螺旋有松、紧、大、小之分，其螺旋的方向也有左旋与右旋之分，大多数种为左旋，少数为右旋。孢子具有不同的形状，有球形、椭球形、杆状、柱状，在光学显微镜下就能看清楚。根据菌体基内菌丝，气生菌丝和孢子丝的这些特征即可判断出分离出的菌体为放线菌。　三、实验材料试剂与仪器设备1、材料：土壤样品（采集生科院门前草地土壤、16号楼内花圃土壤各500g）2、试剂：1）培养基（高氏一号培养基）：可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.42）其他：10ml无菌水、重铬酸钾3、仪器设备：干热高压锅、电热炉、超净工作台、生化培养箱、离心、摇床、电子天秤、采土铲、细目筛、药勺、称量纸、试管架、记号笔、打孔器、镊子、圆滤纸片、1ml吸管、无菌漏斗、培养皿、大烧杯（500ml）、涂玻棒、接种环、酒精灯、试管四、实验步骤1.1土壤样品的采集：在待测田块上，若田块面积小于50㎡，则按对角线三点采样，否则按对角线五点采样。采样一般定于耕作层0-20cm,先除去表土1-2cm,用无菌铲采土足量充分用无菌塑料袋封装。1.2试剂与培养基的制备:高氏一号培养基配制:可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.4）制备培养基。重铬酸钾抑制剂的配置（150mg/L）:称取 150mg 重铬酸钾, 分别放入灭菌三角瓶中, 加无菌水至 1L, 充分溶解后, 进行高压灭菌。含重铬酸钾抑制剂的高氏一号培养基的配置:吸取重铬酸钾抑制剂1 ml 与 9 ml 培养基混匀于培养皿中。1.3酸碱度对放线菌菌落生长的影响1.3.1pH为6.5的含重铬酸钾抑制剂的高氏一号培养基的配置可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.4）制备培养基。吸取150mg/L重铬酸钾抑制剂1 ml 与 9 ml 培养基混匀于培养皿中。使用磷酸二氢钠调节pH为6.5。1.3.2pH为8.0的含重铬酸钾抑制剂的高氏一号培养基的配置方法同上，使用磷酸氢二钠调节pH为8.0。1.4土样分离：1.3.1倒平板：淀粉琼脂培养基加热融化，冷却至55-60℃时倒；1.4.2制备系列稀释：土样室温自然风干（120摄氏度干热处理1h）碾碎过筛取5g→加45ml无菌水振荡10min→取0.5ml注入4.5ml无菌水的试管中此为10-1稀释液（有时也可加入10滴10%酚溶液）以此类推按梯度稀释法稀释至10-3、10-4、10-5；1.4.3涂布：从各稀释度的菌悬液中分别吸取0.1ml涂布在高氏一号的三种不同pH的两个平板培养基上，每个稀释度涂两个平板，共36个平板。1.4.4培养：将已经接种的平皿静置30min后，放入28℃温箱倒置培养5-7d；1.