酿酒酵母代谢工程菌的构及代谢工程研.docVIP

1 木糖还原酶编码序列（XYL1F）的克隆转化 1.1ATCC 58785 树干毕赤酵母基因组的提取 1.1.1菌体干粉的制备 将培养20h的树干毕赤酵母于4500rpm离心10min后收集菌体沉淀，真空干燥，500ml发酵液约得到1.3g干燥菌粉。 1.1.2基因组的提取 采用OMEGA Fungal DNA Mini Kit进行基因组提取。 1.1.3电泳检测 1：λ-Hind Ⅲ digest（3.5uL） 2：21mg菌粉提取的基因组（5uL） 3：31mg菌粉提取得基因组（5uL） 1.2 XYL1基因的PCR扩增 1.2.1 第一次PCR （1）反应体系 Template DNA 2.0ul 10×buffer 5.0ul MgCl2（25mmol/L） 6.0ul X1-primer1（25umol/L） 1.0ul X1-primer2（25umol/L） 1.0ul dNTP（2mmol/L） 4.0ul Taq酶（5u/L） 1.0ul 灭菌超纯水 补齐至50ul （2）PCR扩增程序为： 94℃ 4min 94℃ 30S 61℃ 30S 20个循环 72℃ 60S 72℃ 10min 4℃ 保存 End （3）电泳检测 1：100bp DNA ladder（3.5uL） 2：100bp DNA ladder（3.5uL） 3：21mg菌粉提取得基因组作为模版（5uL） 4：31mg菌粉提取得基因组作为模版（5uL） 5：31mg菌粉提取的基因组作为模版（5uL） PCR扩增失败。 1.2.2 Tm值的摸索 （1）反应体系 Template DNA 1.0ul 10×buffer 2.0ul MgCl2（25mmol/L） 1.5ul X1-primer1（25umol/L） 0.5ul X1-primer2（25umol/L） 0.5ul dNTP（2mmol/L） 2.0ul Taq酶（5u/L） 0.5ul 灭菌超纯水 补齐至20ul （2）PCR扩增程序为： 94℃ 4min 94℃ 30S 52～62℃ 50S 30个循环 72℃ 90S 72℃ 10min 4℃ 保存 End （3）电泳检测 上1：100bp DNA ladder（1.5uL） 上2：PCR Tm为52.3℃（10ul） 上3：PCR Tm为53.7℃（10ul） 上4：PCR Tm为54.8℃（10ul） 上5：PCR Tm为53.7℃（10ul） 上6：PCR Tm为52.3℃（10ul） 下1：100bp DNA ladder（1.5uL） 下2：PCR Tm为56.3℃（10ul） 下3：PCR Tm为58.0℃（10ul） 下4：PCR Tm为59.4℃（10ul） 下5：PCR Tm为61.3℃（10ul） 下6：PCR Tm为62.0℃（10ul） 所以选52.3℃为XYL1 PCR扩增时的退火温度。 1.2.3 XYL1的PCR扩增 （1）反应体系 ①反应体系1 Template DNA 2.5ul 10×buffer 5.0ul MgCl2（25mmol/L） 3.75ul X1-primer1（25umol/L） 1.25ul X1-primer2（25umol/L） 1.25ul dNTP（2mmol/L） 5.0ul Taq酶（5u/L） 1.2ul 灭菌超纯水 补齐至50ul ②反应体系2 Template DNA 2.5ul 10×buffer 5.0ul MgCl2（25mmol/L） 3.75ul X1-primer1（25umol/L） 0.5ul X1-primer2（25umol/L） 0.5ul dNTP（2mmol/L） 5.0ul Taq酶（5u/L） 1.25ul 灭菌超纯水 补齐至50ul ③反应体系3 Template DNA 2.0ul 10×buffer