新型阳离子聚合物作为基因载体的可行性分析-feasibility analysis of novel cationic polymers as gene carriers.docxVIP

第一部分树枝状阳离子聚合物OD-Ds-PAMAM的合成和化学表征目的通过化学方法表征OD-Ds-PAMAM与pDNA形成复合物后的性质，并进一步检测其对DNA的包裹、浓聚、保护能力。方法以聚酰胺-胺PAMAMdendrimers为骨架，结合树枝状分子基源葡聚糖衍生物（OxidizedDextran，OD-Ds，s=2、3、4），并优化合成条件，通过化学方法表征产物的性质。按照一定的N/P比(N/P比是指阳离子聚合物中NH4+与DNA中PO3-的摩尔比例)，阳离子聚合物OD-Ds-PAMAM与DNA均匀混合形成复合物后，在ZetaPALS-电位分析仪上测定纳米复合体的粒径和表面电荷，电子透射显微镜观察纳米复合体的形态和结构。通过琼脂糖凝胶电泳实验研究OD-Ds-PAMAM负载质粒DNA的能力，通过抗核酸酶降解实验研究OD-Ds-PAMAM保护质粒DNA的能力。结果1.纳米材料复合体的粒径和zeta-电位OD-Ds-PAMAM/pEGFP-N3纳米复合体粒径随着N/P从10到60的增大而减小，稳定在140-200nm之间；OD-Ds-PAMAM/pEGFP-N3纳米复合体表面电荷随着N/P比值的增大而增大，在N/P≥40时，电位趋于稳定。2.纳米材料复合物的形态和结构通过透射电子显微镜观察OD-Ds-PAMAM/pEGFP-N3在N/P比为20和40时形成的纳米复合体粒径大小不超过200nm，呈实心球体，粒子分布均匀，随着N/P比值增加，球体缩小。3.琼脂糖凝胶电泳OD-Ds-PAMAM与pEGFP-N3按照N/P比为0.5、1、5、10、20、30、40混合后进行琼脂糖凝胶电泳，结果提示OD-D3-PAMAM和pDNA在N/P比为5时可充分结合，OD-D4-PAMAM和pDNA在N/P≥1时即达到完全结合，而阳性对照组PEI25KD则在N/P≥10时才能完全结合pDNA。4.抗核酸酶实验可见游离的裸质粒DNA分子被DNA酶完全降解，相反，用强离子去污剂SDS解离复合物，对分离出的DNA分子进行电泳分析，未发现断裂或降解的pDNA。说明OD-Ds-PAMAM阳离子聚合物可以保护DNA分子免受核酸酶的降解。结论共合成3种OD-Ds-PAMAM树枝状阳离子聚合物，能有效结合质粒DNA分子，结合后的复合物直径在140-200nm之间，表面带正电荷，能与细胞膜结合并被内吞。为评估OD-Ds-PAMAM在体外的基因转染效率及细胞毒性作用提供实验依据。第二部分树状阳离子聚合物OD-Ds-PAMAM作为传输载体的生物学表征目的通过体外细胞学实验检测载体聚合物OD-Ds-PAMAM的细胞毒性与基因转染能力，优化转染条件，并从中筛选出毒性低、转染效率高的化合物，为进一步体内试验奠定实验与理论基础。方法以市场上应用较广泛、同属非病毒载体阳离子聚合物类的聚乙烯亚胺(Polyethyleimine，PEI）作为阳性对照组，体外培养人胚肾HEK293细胞和神经母瘤SH-SY5Y细胞，并制备含有增强型EGFP基因的表达载体pEGFP-N3，利用噻唑蓝(MTT)比色实验研究OD-Ds-PAMAM/PEGFP-N3载体复合物的细胞毒性作用。然后分别用OD-Ds-PAMAM和PEI两种载体将pEGFP-N3转染到不含血清培养和含10%胎牛血清培养基的人胚肾HEK293细胞和神经母瘤SH-SY5Y细胞中，转染后分别于24或36h用倒置荧光显微镜及流式细胞仪观察转染效果和检测转染效率。结果1.细胞毒性试验：在人胚肾HEK293细胞和神经母瘤SH-SY5Y两种细胞系当中，均可见OD-Ds-PAMAM系列材料显示出低毒性，三种材料的细胞毒性总体上呈现OD-D4-PAMAM＞OD-D3-PAMAM＞OD-D2-PAMAM的趋势。阳性对照组PEI25KD在低浓度时就开始出现明显的细胞毒性，在100μg/ml时细胞几乎全部死亡。OD-D4-PAMAM较对照组PEI25KD显示出较低的细胞毒性，当OD-D4-PAMAM纳米材料浓度为50μg/ml，细胞存活率仍有60.6%（HEK293细胞系中）和71.1%（SH-SY5Y细胞系中）(p0.01)。2.细胞转染试验：两种细胞中，流式细胞仪下研究结果发现，OD-Ds-PAMAM系列纳米材料的转染效率与N/P值有关，当N/P值逐渐增加，转染效率随之增加，而当N/P值达到一定值，表达量不再增加，处于一段平台期后反而下降。人胚肾HEK293中，无血清转染条件下，三种纳米材料的转染效率呈现OD-D2-PAMAM＜OD-D3-PAMAM＜OD-D4-PAMAM的趋势，OD-D2-PAMAM载体化合物的最高转染效率（N/P=30/1）为14.4%，远低于对照组PEI25KD（N/P=20/1）33.1%，故舍弃。OD-D3-PAMAM和OD-D