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E7蛋白检测技术 在宫颈癌早期筛查中的应用 前 言 宫颈癌是中国女性第二大最常见的恶性肿瘤，也是发展中国家女性癌症死亡的主要原因。我国每年新增宫颈癌病人13万多，每年约有5万人死于宫颈癌，且发病年龄明显趋于年轻化，35岁以下的宫颈癌病例出现上升趋势，严重危害妇女健康，因此宫颈癌的筛查和预防具有重要意义。 宫颈癌的发展一般需要10年左右时间，在这期间，若能及早发现癌前病变，就可以有效预防癌症的发生。《2015年美国癌症筛查指南》推荐： 1）21-29岁女性，应单独进行宫颈细胞学检查，每3年1次； 2）30-65岁女性，优先推荐细胞学和HPV联合筛查，每5年1次,也可每3年1次细胞学筛查； 3）对于前10年内细胞学检测连续3次阴性或细胞学和HPV联合筛查连续2次阴性且最后一次筛查在5年内的女性，65岁后应停止任何方式的筛查； 4）任何年龄段都不需要通过任何方式每年筛查。 目前临床常用的宫颈癌筛查方法包括：传统的巴氏细胞学检测、液基薄层细胞涂片、HPV DNA分子检测等。近年来，宫颈癌筛查出现了一系列新技术包括：HPV mRNA检测、“替代性生物标志物”（surrogate marker）检测等。 E7癌蛋白的表达和功能是宫颈癌发生和发展的重要条件 大量研究发现，人乳头瘤病毒（Human papilloma viruses，HPV）与宫颈癌发生发展关系密切，是所有宫颈鳞状细胞癌（SCC）和大部分宫颈腺癌的致癌病原体。目前已经有200多种的HPV亚型被鉴定[1]，根据其致癌性分为高危型HPV（hrHPV）和低危型HPV（lrHPV），其中14种主要高危型HPV与宫颈癌的发生和演变有关。 虽然HPV感染的人群比例很大，但HPV感染不等于宫颈癌，一过性的阳性携带者中80%以上在6到12个月内会自然清除，只有很少一部分会进展到宫颈病变或癌症。持续性的hrHPV感染，使病毒基因得以整合到人体细胞基因组内，启动病毒致癌基因E6，E7蛋白表达。E6，E7蛋白被证明是驱动宫颈癌发展的主要致癌因子[2, 3]。高表达的E7蛋白与Rb结合使Rb-E2F复合物解离，E2F从pRb蛋白中释放，Rb通路失控，反馈刺激p16INK4A、Ki67、细胞周期蛋白A（CyclinA）和细胞周期蛋白E（CyclinE）等在内的众多细胞增殖相关基因的表达，使宫颈上皮细胞的细胞周期发生紊乱。因此，“E7蛋白表达是维持宫颈癌及其高级别癌前病变发展必需的。”—— E7蛋白表达与宫颈癌发展存在因果关系。 细胞学诊断技术进展 自Papanicolaou发明巴氏涂片法以来，巴氏涂片细胞学检查作为宫颈癌的筛查方法已有70多年的历史，作为第一代细胞学检测技术巴氏图片的假阴性率在50%以上；而本世纪初以液基细胞学（liquid based cytology）为代表的第二代细胞学检测技术改善了样本的制片质量，但检测灵敏度在50~70%之间仍不能满足临床需求；以免疫细胞学（immuno-cytology）为代表的第三代细胞学检测技术，代表性产品为罗氏的CINtec PLUS（p16INK4A/Ki67双染），据PALMS研究报道，p16INK4A/Ki67的灵敏度能够达到85%以上[4]。这些替代性的蛋白标志物在正常宫颈细胞中也有内源性表达，由此影响了它们在宫颈癌诊断方面的应用。而仅在高危型HPV转化的宫颈癌细胞中表达的E7癌蛋白无疑是宫颈癌早期诊断的理想标志物[5]。 1514345468829037576.jpg 图1 细胞学诊断技术发展三阶段 E7蛋白标志物在细胞学上的应用 E7-ICC是针对宫颈上皮脱落细胞中来自于HPV基因编码的 E7癌蛋白表达的临床检测新方法，通过使用E7单克隆抗体，能够特异性识别表达 E7蛋白的癌变细胞（试验操作过程如图2所示）。检测结果在细胞样本中出现明显的棕色胞质染色，即可认为该细胞为E7-ICC阳性染色。（临床实验室2016年第9期）。 1514345499594036889.jpg 图2 E7-ICC技术试验程序 采用的液基细胞学制片技术评估E7-ICC技术的临床应用。图3中阳性对照采用高级别鳞状上皮内病变（HSIL）的临床样本，阴性对照为未见上皮内病变（NILM）的正常宫颈上皮细胞临床样本。结果如图所示：在表达E7蛋白的转化细胞中呈现棕色染色，且定位于形态学为HSIL的细胞中（图3A，C）；而在NILM的样本中未检测到E7单抗的染色。值得注意的是，E7癌蛋白是否表达可以用来评估LBC报告（如HSIL，LSIL和ASC-US等）中不同级别宫颈损伤程度的恶变倾向，证明了使用特定的生物标志物解释细胞学结果的可行性。这对于细胞形态学某些不确定病例的分流是非常有必要的，例如ASC-US。如图3E所示：该病例传统细胞学报告为ASC-US，在癌前病变细胞中检