药物热原检测平台—tlr4 md2及cd14基因稳定表达细胞系的构建-construction of tl r4 md2 and cd14 gene stable expression cell line as drug pyrogen detection platform.docx

宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月目录第一部分：药物热原检测平台—TLR4、MD2及CD14基因稳定表达细胞系的构建…….I中文摘要….…………………………………………………………………….……….…I英文摘要….…………………………………………………………………….…...……III前言……………………………………………………………………………..……….1材料与方法…………………………………………………………………….…………..6结果……………………………………………………………………………………….29讨论……………………………………………………………………………………….48结论……………………………………………………………………………………….53参考文献………………………………………………………………………….………54第二部分：三萜类新化合物对顺铂诱导大鼠急性肾损伤保护作用的初步研究….………V中文摘要….…………………………………………………………………………….…V英文摘要….………………………………………………………………………..……VII前言………………………………………………………………………………...……..57材料与方法……………………………………………………………………………….60结果……………………………………………………………………………………….66讨论……………………………………………………………………………………….71结论……………………………………………………………………………………….73参考文献……………………………………………………………………………….…74第三部分：内毒素研究进展及其检测方法（综述）…………………………………………77综述参考文献……………………………………………………………...…………….85中英文缩略语表……………………………………………………………………………..88致谢攻读学位期间发表的学术论文目录个人简历第一部分：药物热原检测平台—TLR4、MD2及CD14基因稳定表达细胞系的构建摘要目的采用基因工程和分子生物学的方法，构建体外稳定表达的Toll样受体4（TLR4）、髓样分化蛋白-2（MD2）和白细胞分化抗原14（CD14）基因细胞学模型，为医用注射类药物的热原检测提供一种简便可行的实验室技术方法。方法1.目的基因的克隆：以pcDNA.3.1-TLR4-YFP质粒为模板，大体系PCR得到TLR4的DNA片段，回收PCR产物连接于pMD19-T载体上进行克隆。取人外周血单核细胞总RNA，利用RT-PCR得到MD2和CD14的DNA片段，回收PCR产物连接于pMD19-T载体上进行克隆。2.表达载体的构建：经过基因序列分析鉴定的pMD19-T-TLR4与pCAG-GFP表达载体同时进行KpnI和SmaI双酶切，将回收片段进行连接，构建成pCAG-GFP-TLR4表达载体质粒；pMD19-T-MD2克隆载体与pCAG-GFP表达载体同时进行KpnI和EcoRI双酶切，将回收片段进行连接，构建成pCAG-GFP-MD2表达载体质粒；pMD19-T-CD14载体质粒与pCAG-GFP载体质粒同时进行KpnI和EcoRI双酶切，将回收片段进行连接，构建成pCAG-GFP-CD14载体质粒。3.质粒的转染及表达检测：构建成功的pCAG-GFP-TLR4、pCAG-GFP-MD2和pCAG-GFP-CD14表达载体质粒通过电转染的方法转染至PC-3M、HIT细胞系，转染后培养细胞48h，在荧光倒置显微镜下观察GFP的表达情况。结果1.利用pcDNA.3.1-TLR4-YFP质粒为模板成功获得人TLR4的DNA，成功构建pMD19-T-TLR4克隆载体质粒，经酶切、测序及BLAST鉴定序列无误。2.利用