实验五金黄色葡萄球菌检测概述 PPT课件.pptVIP

四、实验内容 （一）、增菌培养法 样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分离→→血浆凝固酶试验鉴别→→结果报告 第一天 样品处理和增菌培养 （一）、样品处理 固体或半固体食品：以无菌操作称取25g样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均 质杯内，于8000r/min均质1～2min，制成1:10样品匀液。 　　液体食品:：用灭菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内 (瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇制成1:10样品匀液。 （二）、增菌培养 接种操作：吸取5mL稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中。37°C培养24小时。 培养：放于36±1℃培养24h。 培养结果：在NaCl肉汤中呈混浊生长，胰蛋白胨肉汤中有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长。 第二天 接种选择性平板进行分离培养 （一）、接种选择性平板 取增菌液1环，划线接种于血平板或B－P平板。 （二）、培养 放于36±1℃培养24h。 第三天 观察分离结果、镜检、做血浆凝固酶试验 （一）、观察分离结果 结果：金黄色葡萄球菌，在血平板上呈：金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈；在Baird-Parker平板上：菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带，在其外层有一透明圈。 （二）、革兰氏染色、镜检 操作：革兰氏染色→镜检 结果：金黄色葡萄球菌，革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞，直径0.5-1μm。 （三）、结果报告： 综合形态特征，血平板情况以及血浆凝固酶试验结果，判别检样有否金黄色葡萄球菌作出报告。 金黄色葡萄球菌血浆凝固酶实验 　　取肉汤培养物0.5mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于试管内充分混合,置 36±1℃培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察6 h,以内容物完全凝固,使试管倒置或 倾斜时不流动者为阳性。 1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照， 另1支加入营养肉汤或0.9％无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。 阳性和阴性对照 血浆凝固酶试验 (1)取洁净玻片一张，于两端各加兔血浆一滴。 (2)用接种环取金黄色葡萄球菌苔一环，在玻片一端兔血浆中研磨混匀，接种环灭 菌后再取白色葡萄球菌苔一环，在另一端兔血浆中研磨均匀。 (3)观察兔血浆有无凝集现象。 四.检验和控制1．金黄色葡萄球菌的检验　　样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。　　增菌培养：将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24小时。　　分离培养：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37°C培养24-48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。 　　染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0.5-1μm。　　血浆凝固酶试验：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。　　耐热核酸酶试验：将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，36±1°C培养24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。本试验金黄色葡萄球菌为阳性。 　血浆凝固酶试验：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。 　　耐热核酸酶试验：将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，36±1°C培养24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。本试验金黄色葡萄球菌为阳性。 问题与讨论： 1.血浆与血清的区别是什么？为何凝固酶试验需要用血浆而不是血清？ 2.葡萄球菌产生的凝固酶有几种？实验室检测血浆凝固酶的试验方法有几种？每种方法测定的物质有何不同？哪种方法最好？ 3.血浆中的抗凝剂常用的有肝素、枸橼酸盐、EDTA等，血浆凝固酶试验中所用的血浆抗凝剂以哪种为最佳？是否可用脱纤维血浆？为什么？ 4.血浆凝固酶试验对血浆来源是否有要求？比如动物血、人血等，哪种血源最佳？为什么？ 5.做血浆凝固酶试验时需对血浆进行稀释，你认为血浆的最佳稀释比例是多少？血浆过稀或过浓对结果有影响吗？ 6.