（新编）利用小随体多重PCR和带型分析鉴别酿酒酵母菌株.doc

第一学习小组 段志峰 朱江 邢英超 刁文涛 冯延宾 张熠 唐亦辰 黄云 何骁男 利用微卫星多重PCR和带型分析鉴别酿酒酵母菌株 摘要 我们提出了一种利用多重PCR对微卫星位点多态性分析快速鉴别酿酒酵母菌种的方法。 无需使用苯酚，简单提取DNA，利用多重PCR扩增SC8132X, YOR267C 和SCPTSY7位点，用琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行带型分析，这种方法可使我们区分30种商用葡萄酒酿酒菌种。该方法被成功应用于一项在15和20摄氏度这两个发酵温度下检验两个菌株间的显性关系的生态学研究中。 这种方法在酿酒和酵母生产工业中常规的低成本检测酵母菌株的过程中应该有应用价值。 关键词：微卫星，PCR，酵母菌株，葡萄酒，发酵 1.前言 使用选育出的用于酒精发酵的酵母菌株酿造葡萄酒是现在普遍使用的一种方法。酵母对葡萄酒的质量尤其是口味有很大的影响（在葡萄酒发酵，温度是影响酵母动力学一个主要（Fleet and Heard,1993）;生态研究显示(Epifanio et al., 1999; Torijaet al., 2003). 事实上，酿酒商要求菌株的一个突出特点是能够在特定的温度下进行良好的发酵反应。 很多时候，在一个典型的发酵白葡萄，发酵温度保持18，但达到12-15 ，提高调味品酯减少高酒精形成。在此温度下在过去的几年中，研究侧重于用分子方法菌株分化（Beh et al., 2006） ，如染色体分析法（Carle and Olson,1985; Blondin and Vezinhet, 1988）和限制性片段长度多态性（ RFLP ）分析m （Querolet al., 1992） ，以及基于PCR的方法，其中包括内部转录序列（ ITS ）的核糖体DNA 测序（Montrocher et al., 1998） ，（Cameron et al., 1979;Ness et al., 1993） ，扩增片段长度多态性（ AFLP ）的（De Barros Lopes et al., 1999） ，随机扩增多态性DNA （ RAPD ） （Baleiras-Couto et al., 1996） ， 内含子剪接序列扩增（De Barros Lopes et al., 1996）及PCR内含的线粒体基因（） 。意味着花费大量时间和DNA清理步骤，在某些情况下还需要反应以评估非重复。基于长度多态性的简单序列重复基因位点分散在整个基因组中分析已成功地被用来酵母菌株Field and Wills, 1998;Gonzalez Techera et al., 2001; Pe′rez et al., 2001;Hennequin et al., 2001; Malgoire et al., 2005）。最近，利用对具高度多态性的微卫星位点的多重PCR方法可以分离一系列商用酵母菌株 (Schuller et al., 2004;Bradbury et al., 2005; Legras et al., 2005)。微卫星位点PCR高辨别能力以及其稳定性和实用性使其成为区分酵母菌种最受欢迎的方法之一。这个方法用于常规检测的瓶颈发生在扩增子分析的步骤：利用聚丙烯酰胺凝胶及测序分析仪确定扩增子的大小较为费时费力。为了避免这个限制，有人提出利用简单的高张力琼脂糖凝胶电泳（Routman and Cheverud, 1994;Ferraro et al., 1998) 。最近，Howell 等人（2004）建议利用对SC8132X 位点的PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶加EB染色电泳来进行酿酒酵母的分型。 为了建立一种快速精确并且甚至适用于那些低预算高通量实验室的鉴别菌种的方法，我们对3个高多态性微卫星位点的多重扩增（Gonzalez Techera et al., 2001），然后用琼脂糖凝胶电泳进行带型分析。 作为第一步，我们对一组29种商用酵母菌株进行测试，另加一酿酒酵母菌株作为参考，以检查该方法的鉴别能力。然后，我们在测试发酵温度对共接种的两个选育菌株的生长速率和竞争能力的影响的实验中检查了这种方法的实际适用性。 2.材料与方法 2.1酵母菌株和培养基 酿酒酵母菌株采购于酿酒酵母生产商。酿酒酵母菌株见表1。酵母菌模式菌株（CBS 1171）从CRA-Istituto Sperimentale per l’Enologia of Asti, Italy (ISE)的收集品中获得。 商用干菌株悬浮于无菌5%的蔗糖液体培养基中，40摄氏度下放置30分钟，稀释，然后涂布于YMA平板(10g/L葡萄糖, 5g/L蛋白胨, 3g/L酵母浸出物, 3g /L 麦芽膏和20g/ L琼脂),然后在24摄氏度下培养48小时。 2.2 DNA抽提