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Namalwa：从肯尼亚患有淋巴瘤病 人获取，建成的人的类淋巴母细胞。2.8%的高倍体率，12～14条标记染 色体。单条X，无Y。培养基为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于生产 α干扰素。 第31页/共53页 SP2/0-Ag14：通过融合的方法， 从有羊抗红细胞活性的BALB/c 小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系 P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NL-Ag 亚克隆中分离获得， 第32页/共53页 能耐受8氮鸟嘌呤 20μg/ml但 在含HAT 选择培养基中不能存活。 通常用培养基为DMEM，添加10%胎 牛血清。用于生产单抗杂交瘤细胞 和抗体。 第33页/共53页 Sf-9 1983年从亲代IPLB—SF21AE 中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的 蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺 蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒 高度敏感。 第34页/共53页 通常用的培养基为Grace培养基， 添加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L 酵母浸液, 10%胎牛血清。用于高 效表达外来蛋白制品。 第35页/共53页 四、基因工程细胞构建和筛选 在生产中采用更多的更有前景的是 融合细胞及采用基因工程构建的各 种工程细胞。 第36页/共53页 被用构建工程细胞的动 物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、 Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。 第37页/共53页 ⒈真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类： ㈠病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、 杆状病毒 ㈡质粒载体 第38页/共53页 牛痘病毒： 用构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒： 用于基因治疗。 杆状病毒： 用于外源基因表达。 第39页/共53页 其作为载体的 优点： ①双链DNA，易重组 ②插入7～8kb DNA不影响正 常病毒粒子的形成。 第40页/共53页 ③多角体蛋白和病毒粒子的形 成无直接关系，因此用外源基因 更换多角体蛋白基因，仍能形成 有感染力病毒粒子； 第41页/共53页 ④多角体蛋白基因有非常强的 启动子，产生的蛋白质可占全 部蛋白质的20%～30%； 第42页/共53页 ⑤用光学显微镜可看到多角体， 可以此作为标记物，选阳性克 隆。 ⑥如用家蚕杆状病毒，还可在蚕 体表达外源基因。 第43页/共53页 质粒载体在细菌和哺乳动物细胞 体内都能扩增。都含有如下基本 成分： ①允许载体在细菌体内扩增的质 粒序列。 ②含有使基因表达的调控元件。 第44页/共53页 ③能用以筛选出外源基因已整 合的选择标记。 ④有时还带有选择性增加拷贝 数的扩增系统。 第45页/共53页 ⒉基因载体的导入和高效表达工程细胞株 的筛选 第46页/共53页 基因载体导动物细胞 常用方法是： 磷酸钙沉淀法 电穿孔法 第47页/共53页 磷酸钙沉淀法：溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中， 形成DNA—磷酸钙共沉淀物，当 和细胞表面接触时，则通过细胞 吞噬作用而将DNA导入。 第48页/共53页 电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场， 使细胞膜出现瞬时可逆性小孔， 外源DNA沿小孔进入细胞。转 化率较高，拷贝数低。 第49页/共53页 五、细胞库的建立 生产用的工程细胞必须建立两个细胞库： ⒈原始细胞库 ⒉生产用细胞库 第50页/共53页 ⒈原始细胞库贮存时须有该细 胞的详细挡案，包括： ①该细胞系的历史 ②该细胞系的特性 ③对各种有害因子的检查结果 第51页/共53页 ⒉生产用细胞库 从原始细胞库来的，或从单 一安瓶来，或从多个安瓶来 即刻混合，经培养扩增再分 装储存形成细胞库。 第52页/共53页 需建挡案， 进行无菌性无细胞交叉污 染的检查。 需确定最高使用的传代数。 第53页/共53页 第一节 概 述 细胞学说的建立 组织培养和细胞培养 细胞工程学 第1页/共53页 第二节动物细胞的形态和生理特点 一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异。 离体培养细胞分两类： 贴壁细胞 悬浮细胞 第2页/共53页 第3页/共53页