二十基因工程药物new.pptxVIP

第一节 概述定义 基因工程是通过对目的基因的掺入，拼接和重组而实现遗传物质的重新组合，再借助质粒，病毒或其他载体将目的基因转移到新的宿主细胞系统内进行复制和表达的新技术。基因工程是现代生物技术的主体及核心。又称DNA 重组，基因克隆等。 基因工程技术最成功的应用就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。1982年人胰岛素在美国的问世，带来了巨大的经济和社会效益。生物技术用于疾病的预防和疑难杂症的治疗已经成为了现实。主要的人和事发展现状 美国作为最早开展基因及基因工程研究的国家，自基因工程诞生以来处于世界领先地位。拥有生物技术公司2000余家，其中300余家上市公司。欧洲约有1000余家生物技术公司。亚洲的日本，韩国和印度也获得了极大的发展。 我国生物技术起步较晚，但是受到了国家的高度重视，发展速度也是十分惊人。1997年我国自主生产了第一个基因工程药物重组干扰素。目前世界上排名前十位的重要基因工程药物我国都能自主生产。我国已批准上市的基因工程药物和疫苗表26-1基因工程药物的特点稳定性差，易腐败。使用用量低，药理活性高。具有细胞和组织特异性。给药方式有特定要求。主要的基因工程药物基因工程技术的优点可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障。可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质。利用基因工程技术改良药物，获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 基因工程菌的制备目的基因的获取载体的制备目的基因与载体的连接转化转化子的鉴定和鉴别目的基因的获取反转录法 以富含目的基因的实验材料提取RNA，在逆转录酶的作用下获得cDNA，以此为模板进行PCR扩增，最终合成编码多肽的双链DNA序列，这是制取真核生物目的基因常用的方法。人工合成法化学合成法：利用特殊的化学试剂将相邻的两个核苷酸以3’, 5’-磷酸二酯键 相连，逐渐延长获得目的基因序列。聚合酶链式反应：根据已经基因的核苷酸序列，设计引物，利用PCR技术分 段和成基因片段最终获得全长基因。载体的制备 外源基因必须导入适合的细胞内才能实现克隆，表达。这一过程依赖于载体的转运，外源基因片段与载体连接是DNA重组技术的关机步骤之一。 根据受体细胞的不同，载体的选择也是不同的，主要包括以下载体：质粒载体λ噬菌体柯斯质粒单M13噬菌体动植物病毒的衍生物质粒载体 质粒载体是存在于细菌（酵母）细胞质中的一种独立于染色并能自主复制的一类遗传物质。大多数质粒成环状。通常是游离于染色体之外单独复制，也可在特殊状况下整合入基因组DNA中共同复制。提取大量完整的质粒是制备重组质粒的前提基础。（天然：pSC，RDF；改进：pUC，pBR，pET）λ噬菌体载体 λ噬菌体基因组长度48.5kb，基因组中处的一连串基因并非噬菌体形成所必需的，若用外源DNA片段取代这个区域，不会影响噬菌体的形成，这也是λ噬菌体能够作为质粒载体的的前提条件。通过人工改造得到的λ噬菌体载体可以分为插入型和替换型。插入型：可用于组建cDNA文库，可容纳10kb以下的片段。（组织细胞特异性）替换型：可用于组建基因组文库，容纳20kb左右的片段。柯斯质粒载体 柯斯质粒是一类人工构建的特殊质粒载体。含有λDNA的cos序列，质粒复制子，抗药性标记，一种或几种限制性内切酶单一位点。具有λ 噬菌体和质粒的优越性，又具有高容量的克隆能力，容纳外源DNA的长度可达45kb。腺病毒载体 腺病毒可以携带外源基因通过受体介导的内吞作用进入细胞核内，但不整合入基因组中，实现高效转染，复制。转染效率达100%。脂质体载体 是一种人工膜，可以和细胞膜融合从而实现外源基因的转染，可以做到缓释，毒性低。目的基因与载体的连接方法一：加同聚尾连接。 用3‘末端脱氧核苷酸转移酶催化，使载体与cDNA的3’末端带上互补的同型多聚体序列，如载体加上polyC（或A）的尾巴，则cDNA加上polyG（或T）的尾巴，这两种粘性末端只能使载体与cDNA连接而不能自我环化，借助同型多聚体的退火作用形成重组分子，最后用T4DNA连接酶封口。优点：不易自身环化。因为载体和外源片段的末端是互补的粘性末端，所以连接效率较高。用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接, 通用性好。目的基因与载体的连接方法二：加人工接头连接 用T4DNA连接酶在平末端接上人工接头可以使DNA发生连接。所谓人工接头是指人工合成的、连接在目的基因两端的含有某些限制酶切位点的寡核苷酸片段。cDNA连上人工接头后，用该种限制酶酶切就可得到粘性末端，从而能够与载体连接；cDNA中也可能也带有同样的限制酶切点，为了保护cDNA不受限制酶破坏，可