细胞凋亡检测生化特征的检测方法琼脂糖凝胶电泳1常规的琼脂.PDFVIP

中国试剂网 3.8.8.70 细胞凋亡检测：生化特征的检测方法 一、琼脂糖凝胶电泳 1）常规的琼脂糖凝胶电泳 方法一： 1．收集细胞 （5 ×106）1000r/min，离心5min，去上清。 2 ．PBS 洗一次，1000r/min，离心5min，去上清。 3 ．加细胞核裂解液500 μl 重悬细胞，50℃水浴，3～5h，不时振摇或37℃过夜。 4 ．加0.5ml 平衡酚抽提，上下颠倒几次混匀，6000r/min，离心5min 。 5 ．上清移至另一Ep 管，加0.5ml 氯仿：异戊醇抽提，上下颠倒几次混匀，6000r/min， 离心5min 。 6 ．上清移至另一Ep 管，加50 μl 的3mol/L 乙酸钠和2ml 预冷无水乙醇，上下 颠倒几次混匀，可见絮状白色沉淀物。 7 ．置液氮5～10min，12 000r/min 离心10min 沉淀DNA ，去上清，真空抽干或 风扇下吹干残存液体。 8．加50～100 μl TE 缓冲液，另加5 μl RNase，37℃水浴30min 。 9 ．取20 μl 加上样缓冲液2～5 μl，1％琼脂糖凝胶电泳 （电压50V，1.5～2h ）， UV 下观察。 方法二： 1．离心收集细胞 （5 ×106），PBS （无Ca2 ＋和Mg2 ＋）洗1～2 次。 2 ．0.5ml TBE 溶液重悬，37℃孵育30min 。 3 ．1mg/ml 蛋白酶K 37 ℃处理30min 。 4 ．加入上样缓冲液0.1ml 。 5 ．25 μl 上样，1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，2V/cm 6h 。 方法三： 1．收集细胞悬液 （106 细胞），低速离心 （1000r/min，离心5min ）。 2 ．去上清，沉淀加0.4ml 低渗缓冲液作用1h。 3 ．13 000r/min，离心10min，将上清转移至另一Eppendorf 管中，加等量50 ％ 中国试剂网 3.8.8.70 异丙醇和0.5mol/L NaCl 混匀，置液氮5min 。 4 ．12 000r/min，离心10min，弃上清，沉淀真空抽干。 5 ．加TE 100 μl，65℃加热10min，取20 μl，加1～2 μl 上样缓冲液，电泳观 察。 方法四： 1．收集细胞，1000r/min 离心5min，去上清。 2 ．用冰预冷的70 ％乙醇固定，可长期保存于－20 ℃冰箱。 3 ．1000r/min 离心5min，去除固定液，用约0.5ml 的PBS 重悬细胞。 4 ．转入Eppendorf 管中，同法离心，去上清。 5 ．细胞用40 μl PC 缓冲液重悬，室温30～60min 。 6 ．1000r/min 离心5min，吸上清于新的Eppendorf 管中，真空浓缩15min。 7 ．加入0.25 ％ NP-40 溶液3 μl，1mg/ml RNase A 溶液3 μl，37℃，30min 。 8．加入3 μl 蛋白酶K ，37℃，30min 。 9 ．加入12 μl 样品稀释液，含溴化乙锭的1.5％琼脂糖电泳，观察。 2 ）琼脂糖凝胶电泳的定量检测 简易末端标记法 1．按常规提取细胞DNA 。 2 ．在0.5ml 的EP 管中加入细胞DNA ，反应体系如下：细胞DNA 0.5～1.0 μg， 10×缓冲液2 μl，32P-dATP （或-dCTP ）0.5 μCi，Klenow 聚合酶5U，双蒸水加 至20 μl 。 3 ．混匀后稍加离心，室温反应30min 。 4 ．加1 μl 0.5mol EDTA 终止反应。 5 ．常规酚/氯仿/异戊醇抽提1 次，无水乙醇沉淀DNA ，真空抽干。 6 ．溶于20 μl 的