层析基本原理及工艺的建立.pptVIP

Chromatography Techniques Content Principles of Operation Terms Parameters Advantages Disadvantages of different techniques Optimization of separation techniques Principles of Operation for Chromatography Techniques 为何选择层析作为生物分子纯化方法？ 不产生热 不产生外力 高回收率 高分辨率 线性放大，可预期 可自动化 大量成功例子 专门分离和纯化各类生物分子 在AKTAprime 上用 HiTrap Desalting 柱脱盐 利用 SOURCE 5RPC ST 4.6/150 柱做肽图分析 合成 DNA 寡核苷酸的纯化 天然蛋白:用 HiTrap IgY柱从蛋黄中快速纯化 IgY Alkaloid Scale up on SP SrHP 开发纯化工艺的注意点 建立检测方法 确立目标 (纯度和产量) 目标蛋白的性质 使用不同原理的纯化方法 减少步骤 尽量减少每步之间样品条件的改变 选用高选择性的方法 - 提高效率 快速去除蛋白水解酶 在早期步骤中缩小样品体积 工艺方法尽量简单! 准备工作 考虑: 纯度水平 需要量 保持生物活性 有效和经济 蛋白质特性: 稳定性 - pH - 离子强度 - 温度 分子量 等电点 样品准备 考虑: 根据蛋白质来源选择不同萃取方法 使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶 在室温以下快速处理 用缓冲液维持 pH, 离子强度 目的: 稳定样品 选择层析方法 若对目标蛋白或样品不大了解，可尝试以下方法： 用分离范围宽广的凝胶过滤介质如Superose, Sephacryl HR依据分子量将样品分成不同组份 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白， 一步即可得到高纯度样品；亦可用各种活化偶联介质 偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质 体积大的样品，往往使用离子交换层析来浓缩和粗纯 化；高盐洗脱的样品再用疏水层析纯化 疏水层析用高盐吸附，低盐洗脱的原理，洗脱的样品 又可直接上离子交换介质；两种方法常被交替使用 The three stages in downstream processing 适用於三步纯化策略的层析技术 吸附性层析的凝胶基架 在纯化步骤的选择 衔接层析技术时注意事项 rhGM-CSF fr E.coli inclusion bodies 选择纯化设备 多步纯化 (非融合性蛋白或需要更高纯度) 工艺开发和优化 法规需要 e.g. GLP/GMP 纯化工艺放大 转移工艺到更大规模 ?KTA? - 一个全面的纯化平台 BioProcess Media 适用於研究和生产 放大容易 高重复性 高物理,化学稳定性（介质 寿命特长） 易於清洗,消毒及再生 高动力载量,流速快缩短生产周期和次数，节省凝 胶用量(尤其XL介质，载量可比普通介质高达10倍！) 供应稳定 线性放大 ?KTA? explorer10 STREAMLINE 扩张柱床吸附技术 配合STREAMLINE填料和层析柱使用 粗样无需离心，过滤，直接上柱 层析法回收率高，选择性多，可自动化 取代离心和超滤设备 大型层析柱 多种大小,材料可供选择,柱床体积高达千多升 也可以订做 经济型 INdEX 和 层叠柱 制药用BPG 和CHROMAFLOW 柱 极高标准的 BPSS 柱 专为 SOURCE 填料设计的 FineLINE 柱 谢谢欢迎您随时和我们联系support@北京 (010) 8838 5742上海 (021) 5080 0260广州 (020) 8732 0255香港 (852) 2811 7575 Step Purity ? further removal of most proteins ? further removal of most nucleic acids ? further removal of endotoxins ? further removal of viruses ? initial purification ? stabilization ? clarification ? concentration ? achieve final purity and safety ? additional safety measure Polishing Capture Intermediate Purification 蛋白质性质 层析技术 净电荷 离子交换(IEX) 大小 凝胶过滤(GF) 疏水性 疏水层析(HIC),  反相层析(RPC) 生物辩识