一个系统的分子实验（转）.docVIP

一个系统的分子实验（转） 实验原理及步骤 2.1PCR扩增制备目的基因 2.1.1原理 是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。其中25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。 2.1.2试剂 2X PCR MIX缓冲液（3U/μl Taq DNA聚合酶，10×BUFFER，25mM MgCl2，dNTP），引物，模板质粒TA-VP4-ST，无菌dd water（双蒸水）。 2.1.3实验准备 TAE电泳缓冲液，1000?溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10?加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。 目的基因模板质粒：模板质粒TA-VP4-ST   待扩增的NK片段长度：872bp (BamH I位点GGATCC，SalI位点G TCG AC。 2.1.4操作步骤 在0.2ml PCR 微量离心管中配制20μl反应体系。   PCR反应体系如下：                  成分                            体积（μL）         2×PCR mix                         10        上游引物 (20μM)