与cvb3 3a相互作用的人心脏蛋白的筛选及功能初探-screening of human cardiac protein interacting with cv b3 3a and preliminary study on its function.docxVIP

emp24（Transmembrane emp24 protein transport domain containing 4,TMED4），细胞色素 c 氧化酶亚基 I（Cytochrome c oxidase subunit I,COX1），细胞色素 c氧化酶亚基 III（ Cytochrome c oxidase subunit III,COX3 ） 和 肌球 蛋 白重链 （Myosin heavy chain,MYH7）/琥珀酸脱氢酶亚基 D（Succinate dehydrogenase complex subunit D,SDHD）；7. SD/–Ade/–Leu 和SD/–His/–Leu 营养缺陷培养基和酶底物 X-α-Gal 颜色的 变化情况显示 6 种阳性蛋白对报告基因无转录自激活作用，回返配合实验初步 验证 6 种阳性蛋白与 3A 蛋白存在相互作用；8. 高内涵细胞成像分析系统显示宿主蛋白 TMED4 主要在胞浆中表达，而病毒蛋白 3A 主要表达在胞浆核周区域，提示 3A 与 TMED4 在细胞胞浆内存在 共定位现象；9. 在质粒 pBudCE4.1-3A 转染后的细胞中，3A 蛋白能够被 anti-TMED4 抗 体共沉淀，而 TMED4 也能够被 anti-His-tag 抗体共沉淀。细胞内免疫共沉淀结 果提示：在质粒 pBudCE4.1-3A 转染后的细胞内，3A 与 TMED4 能够发生相互 作用；10. CCK-8 法结果提示：质粒 pBudCE4.1-3A 转染细胞后 36 h 时间点细胞活 性与空质粒转染组相比明显下降，且差异具有统计学意义，而转染 24 h 和 48 h 时间点的细胞活性与空质粒转染组相比无明显差异；11. 高内涵细胞成像分析系统观察早期凋亡细胞：质粒转染后 36 h，3A 转 染组凋亡细胞数较空质粒转染组有明显增高，且差异具有统计学意义，而转染 24 h 和 48 h 时间点两组细胞并无明显差异；12. 流式细胞仪检测结果显示：转染 3A 的细胞组 G1 期细胞比例一直高于 转染空 质粒的 对照 组 ， 54 h 细胞 组 G1 期细胞 比例差 异具 有 统计学 意义 （P0.05），而 S 期、G2 期的细胞比例没有明显变化。13. 收集质粒转染和活病毒感染各时间点细胞蛋白裂解液，Western Blot 检 测结果： 3A 转染细胞后，细胞内的 TMED4 表达量逐渐下降，于转染 36 h 时 间点达到最低，随后开始回升，至 60 h 后维持稳定；空质粒转染对照组细胞内 TMED4 表达量未发现明显改变；CVB3 活病毒感染细胞后细胞内 TMED4 的表 达逐渐下降，于感染 9 h 时间点达到最低，随后开始回升，正常细胞对照组 TMED4 表达量无明显改变。质粒转染实验和活病毒感染实验两项结果存在一 致性。结论：1. 以 CVB3 3A 为诱饵，应用酵母双杂交技术，成功从人心脏 cDNA 文库 中筛选获得 6 种与 3A 相互作用的人心脏蛋白：RyR2 、SPCS2 、TMED4、 COX1、COX3 和 MYH7/ SDHD；2. 3A 与阳性蛋白 TMED4 在细胞内可能存在相互作用；3. 3A 在细胞中的表达影响细胞的活性，并通过下调 TMED4 的表达量来参 与细胞凋亡；关键词： CVB3； 非结构蛋白 3A； 酵母双杂交系统；蛋白相互作用。国家自然科学基金资助项目（N o. 国家自然科学基金资助项目（ No. 江西省青年科学家培养项目年度计划资助（2013 3BCB23005） 江西省自然科学基金（20122BAB205042）ABSTRACTObjective:To screen CVB3 non-structure protein 3A interactive proteins in the human heart cDNA library by yeast two hybrid system; to analysis the interaction between 3A and the resulting cell protein TMED4 in order to study the molecular mechamnism of CVB3 infection.Methods:Construction of recombinant bait vector of CVB3 3A: After the 3A gene was amplified by RT-PCR, the PCR product was inserted into the pGBKT7 and the bait plasmid p