基因工程-第六章 大肠杆菌表达体系.ppt

第六章 外源基因在大肠杆菌中的表达 基因工程的重要目标之一是,制备用其他方法难以生产的大量的纯化蛋白质产物。为此就需要有一种能够高水平表达异源真核蛋白质或重组蛋白质的表达系统。而良好的表达系统的选择要考虑多方面的因素，如寄主细胞的生长特性、蛋白质产物转移后的修饰与生物活性，以及异源蛋白质的表达水平及分泌方式等。目前这种表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性： 6 外源基因在大肠杆菌中的表达 一般来讲，要构建一个较好的表达载体，应从以下几个方面考虑： 1·转录启动子和终止子的特点； 2·核糖体结合位点的强弱； 3·基因拷贝数及其是存在于质粒中，还是整合到寄主基因组中； 4·合成的外源蛋白在细胞中的定位； 5·寄主的翻译效率； 6·克隆基因所表达的蛋白在寄主中的自身稳定性； 可使外源基因高效表达的最佳启动子应具备的条件： 1、是一种强启动子，能使克隆基因的蛋白表的占细胞蛋白总量的10％～30％以上。 2、应能呈现一种低限的基础转录水平。在表达毒性蛋白质或有损于寄主生长的蛋白质时，使用高度抑制型的启动子是一个极为重要的条件。 3、这种启动子应是诱导型的。能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。如大批量的蛋白质制备中，热和化学诱导便是两种广泛使用的方法。 启动子 启动子的分离 1、将目标原核细胞的染色体DNA用某一种限制性内切酶切成小的DNA片段。 2、将这些DNA片段分别插入到一个缺乏自身启动子的报告基因的上游（报告基因大多编码抗生素抗性蛋白，可通过抗性来确定该基因的表达情况）。 3、通过抗性筛选表达强度高的克隆。 4、对报告基因前的插入DNA片段进行分析，即可得到活性启动子 将经过限制性内切酶酶解过的外源染色体DNA片段克隆进pKO1的单酶切位点，随后转化宿主细胞（GalE+、 GalT+、GalK-）。然后将转化菌涂布于以半乳糖为碳源的McConkey`s培养基上，如果插入的DNA片段是一个有功能的启动子，细胞中会产生有活性的半乳糖激酶，能使半乳糖发生糖酵解，菌落变红。而不能利用半乳糖的则菌落为乳白色。 McConkey`s培养基：除了具有普通细菌培养基常用的蛋白胨、氯化钠及琼脂之外，还含有作为pH值指示剂的中性红和结晶紫，以及待检测的碳水化合物（如乳糖或半乳糖等）。生长在麦氏培养基上的细菌能够利用碳水化合物的形成红色菌落，而不能利用碳水化合物的则形成乳白色的菌落。 采用galK为报告基因的pKO1载体系统优点： 1、可以根据转化子细胞中半乳糖激酶的产量的多少，鉴定启动子的强弱； 2、根据在麦氏培养基中的菌落颜色特征，分离功能启动子。 启动子分离 (2)酶保护法分离。这种方法是依据RNA聚合酶与启动子区域的特异性结合原理设计的。 将大肠杆菌基因组文库中的重组质粒与RNA聚合酶在体外保温片刻，然后选择合适的限制性内切酶对其进行消化，未与RNA聚合酶保温的同一重组质粒作酶切对照。如果试验质粒的限制性片段比对照质粒减少，则表明被钝化的酶切位点位于RNA聚合酶保护区域内，即该区域存在启动子结构。将这个区域的DNA片段次级克隆在启动子探针质粒上，测定其所含有启动子的转录活性。 启动子分离 (3)滤膜结合法分离。其原理是双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA-蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上。将待检测DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移保温混合物至膜上，温和漂洗薄膜，除去末结合RNA聚合酶的双链DNA片段，然后再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA片段洗下。一般来说，这种DNA片段在膜上的滞留程度与其同RNA聚合酶的亲和性(即启动子的强弱)成比例， 然而这种强弱难以量化，通常仍需要将之克隆在探针质粒上进行检测。 实际操作中人们常用lacUV5启动子，它是由lac启动子衍生而来，含有一对突变碱基。野生型的lac启动子要启动转录必须具备两个条件：活化蛋白和cAMP等正调控因子，和乳糖或IPTG等解除负调控的物质同时存在。而lacUV5比野生型lac启动子更强，且对葡萄糖代谢分解产物抑制不敏感，不需要活化蛋白和cAMP。在仅有乳糖或IPTG存在时就能启动转录。 双质粒表达系统 用trp启动子驱动编码cI阻遏蛋白的基因，然后将他们置于一个低拷贝的质粒上；将需要表达的基因置于PL启动子的下游，使其表达受PL启动子的调控。 采用这种双质粒系统，细胞可以用很便宜的含糖浆（molasses）及酪蛋白水解物的培养基进行培养，这种培养基只含有少量游离的色氨酸。在进行诱导时，向培养基中加入蛋白胨，它含有足够的色氨酸。 C 大肠杆菌工程菌构建策略 导致异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中不稳定性的主要原因： (1)大肠杆菌缺乏针对异源重组蛋白的拆叠复性和翻译后加工