《微生物与发酵工程》第2章 微生物菌种选育3、4节.ppt

第二章 微生物菌种选育 第三节 菌种退化和菌种保藏 一、菌种退化 菌种退化的概念 菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。 菌种退化的表现 形态上 生理上 遗传上 菌种退化的判别 与杂菌污染和发酵条件不当的区别 一、菌种退化 （一）引起菌种退化的原因 核基因突变 核心原因，基因的负变不可避免 连续传代 群体退化的关键因素 其它因素 通过原因1起作用 （二）防止退化的措施 合理的育种 关键点包括：避免表型延迟（2种）、增加突变位点 一、菌种退化 选用合适的培养基 关于应使用“营养贫乏的培养基” 创造良好的培养条件 保藏和发酵有不同的最适条件 控制传代次数 改进保藏方法 采用有效的菌种保藏方法 根本措施之一 一、菌种退化 （三）菌种的复壮 概念 通过纯种分离和生产性能测定淘汰负变个体，保证菌株生产能力的稳定。概念的外延有狭义的和广义的两种。 常规方法 即从退化菌种的群体中找出少数尚未退化的个体，然 后扩大培养之即可。常用方法有：梯度稀释法、平板 划线法和组织分离法。此即菌种的自然选育工作，也 是防止衰退的另一个重要措施。 特殊方法 如通过寄主复壮、再次诱变复壮等。 二、微生物菌种保藏 微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂等方法，使微生物处于代谢不活泼，生长受抑制的环境中。 常见方法见表2-1. 三、菌种保藏机构 参见教材P69~70，课下阅读。 第四节 微生物菌种扩大培养 一、种子的概念和标准 种子和种子扩大培养的概念 将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程即种子扩大培养。这些纯种培养物称为种子。 种子扩培的目的 接种量的需要 菌种的驯化的需要 缩短发酵时间的需要 一、种子的概念和标准 种子质量标准 一般要求处于对数期晚期（种龄） 形态及理化指标达到要求。（种质） 菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短。（种质） 无杂菌污染。（种质） 总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；（种量） 二、种子的制备过程 二、种子的制备过程 孢子的制备 霉菌孢子的制备 一般以大米、麸皮、棉籽壳、稻壳等天然农产品为培 养基。培养的温度一般为28℃左右，培养时间一般为 1~2周。 放线菌孢子的制备 采用琼脂斜面培养基，再添加一些适合产孢子的营养 成分，如麸皮、豌豆浸汁等。一般28℃培养1~2周。 酵母菌孢子的制备 类似放线菌，也有特殊的产孢培养基。 二、种子的制备过程 种子的制备 一般是斜面→摇瓶→种子罐的路线，注意种子罐 级数的确定。 培养基一般就选用普通培养基，营养较发酵培养 基更丰富些。 三、种子质量的控制 影响种子质量的因素 培养基 培养条件（时间、温度、湿度） 保藏条件 种子质量的控制措施 规范种子制备过程 定期进行自然选育和无菌检查 * * * * 5年左右 所有 低温 缺氧 无营养 安瓿管防冻剂超低温冰箱保藏 超低温冷藏 1~10年 产孢子真菌 产芽孢细菌 无营养 干燥 灭菌沙土管干燥保藏 干燥-载体保藏 1~2年 所有 低温 缺氧 密封斜面 冰箱冷冻保藏 普通冷藏 1~2年 所有 低温 缺氧 斜面灭菌石蜡封口冰箱保藏 矿物油中浸没保藏 数月 所有 低温 斜面冰箱保藏 定期传代 斜面传代保藏 数天 好气性细菌 酵母 无营养 悬浮于无菌蒸馏水 蒸馏水悬浮法 保藏期限 适宜菌种 原理 方法 名称 表2-1 常用菌种保藏方法及其原理 依具体保藏方法而定 基因工程菌 依具体保藏方法而定 选择压 基因文库 基因工程菌的保藏 依具体保藏方法而定 病毒等寄生性微生物 依具体保藏方法而定 寄主代替普通培养基 寄主保藏 20年以上 所有 低温 缺氧 无营养 安瓿管防冻剂液氮冷藏 液氮冷冻保藏 10年 所有 低温 缺氧 干燥 无营养 安瓿管保护剂冷冻减压封口 冷冻干燥保藏 续表2-1 常用菌种保藏方法及其原理 超低温冰箱 超低温冰箱（Ultra-low temperature freezer）又称超低温保存箱、超低温冰柜、超低温保存箱等，工作温度一般在-50℃~-90℃，采用两级制冷，广泛用于工业生产和科学研究。 冷冻干燥机 冷冻干燥机系由制冷系统、真空系统、加热系统、电器仪表控制系统所组成。主要部件为干燥箱、凝结器、冷冻机组、真空泵、加热/冷却装置等。 在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段(图2-1)：实验室阶段和生产车间阶段 。 图2-1 种子扩大培养流程图 1、砂土孢子；2、冷冻干燥孢子；3、斜面孢子；4、摇瓶液体培养