25病毒感染的检查方法与防治原则课件.pptVIP

第25章 病毒感染的检查方法与防治原则 内 容 二、检查方法 ? 病毒的形态学检查 ? 病毒的血清学检查 ? 病毒的分子生物学检查 ? 病毒的分离培养与鉴定 1. 病毒形态学检查 电子显微镜：可观察各种病毒的形态 但设备贵、操作复杂，应用受限 光学显微镜：可观察大病毒（痘病毒）和包涵体 对一般病毒检测意义不大 Electronmicrographs 2. 病毒血清学检查 2. 病毒血清学检查 (1) 中和试验(Neutralization test) (2) 血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test) (3) 免疫标记法(FIA、EIA、RIA) ⑷ 蛋白印迹(Western blot) Immunofluorescense test 3. 病毒分子生物学检查 ? 可用于检测常规培养系统不能培养的病毒 ? 可用于检测少量标本或含少量病毒的标本 ? 可用于抗体产生前或不能产生抗体的免疫缺陷患者检测 ? 可对病毒进行定量检测，有助于疗效监测 ? 可对病毒进行基因分型 ? 灵敏度高、特异性好、快速、简捷 3. 病毒分子生物学检查 ? 核酸电泳(nucleic acid electrophoresis) ? 核酸杂交(nucleic acid hybridization) ? 核酸扩增(PCR） ? 基因芯片(gene chip) ? 基因测序(gene sequence) 动物：鼠、兔、猴、黑猩猩等 优点：结果易观察，可建立动物模型 缺点：有饲养条件要求，费用高、动物 体内常带有潜伏病毒。 目前已很少应用。 鸡胚接种部位： (3) 细胞培养(cell culture) 根据细胞生长的方式分: ? 单层细胞培养（monolayer cell culture） ? 悬浮细胞培养（suspended cell culture） 根据细胞来源、染色体特征及传代次数分: ? 原代培养细胞 ? 二倍体细胞株 ? 传代细胞系或株 特点: ? 对多种病毒敏感 ? 生长能力有限, 获取成本高 ? 可携带潜伏病毒 应用: ? 病毒分离与鉴定 ? 病毒学实验研究 ? 不能用于制备疫苗 病毒鉴定： ⑴ 细胞病变效应( cytopathic effect,CPE) 蚀(空)斑形成试验（plaque assay） 原理：适当浓度的感染性病毒在覆盖琼 脂的细胞层上产生可见和可数的局部病 灶称为蚀斑。一个蚀斑是由一个感染性 病毒颗粒增殖而形成的，由蚀斑的数目 可以计算出原始标本中感染性病毒的含 量。 蚀(空)斑形成试验（plaque assay） 蚀(空)斑形成试验（plaque assay） 用途： ? 测定感染性病毒量 单位: PFU (plaque forming unit)/ml 由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一个空斑称为空斑形成单位。 ? 分纯病毒 50%组织细胞感染量(50% tissue culture infectious dose, TCID50) 概念: 测定病毒感染细胞后引起50%细胞病变或 死亡的最小病毒量。 方法:一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释，分 别接种细胞，经一定时间后观察CPE、血细胞吸 附等指标，以能使50%细胞感染的病毒的最高稀 释度作为终点。最后用统计方法计算出50%组织 细胞感染量。 用途: 测定感染性病毒的量和毒力 50%组织细胞感染量(TCID50) SARS冠状病毒的分离和鉴定 香港大学专家：患者鼻咽标本→Vero细胞培养→CPE →EM观察：冠状病毒 随后加拿大和美国CDC等SARS国际协作组的多个实验室也培养出了冠状病毒 利用‘免疫荧光法’将分离病毒与SARS患者血清进行血清学检测，反应呈阳性 从冠状病毒基因组的保守区设计引物，采用RT-PCR方法从培养上清中扩增出了冠状病毒基因→测序→经Genbank数据库同源性比对，发现同源性为64%左右 SARS冠状病毒的分离和鉴定 加拿大专家完成了全基因组测序→发现与已知人和动物的冠状病毒的同源性差异较大→确定为一种新的冠状病毒。 荷兰的病毒学家：用这种冠状病毒感染猴子→出现了与SARS病人相同的临床表现和病理特征→再次从动物学实验证实引起SARS的病原体是这种冠状病毒 WHO将其命名为SARS冠状病毒 ③传代细胞系(continuous cell line ) 特点: ? 对多种病毒敏感性高 ? 繁殖能力强,传代时间长 ? 有致癌危险(来源于癌细胞或突变的二倍体细胞株) 应用: ? 病毒分离与鉴定 ? 病毒学实验研究 ? 不能用于制备疫苗 能在体