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HPLC的介绍 1 HPLC原理流程图 2 3 在层析分离法中，组成复杂的物质皆溶于一个动相，它可以是一种液体、气体或是超临界流体。此动相接着被迫流入一个不互溶的静相中，它已被固定于管柱内或一表面上。 这两相的选取乃为了使样品中的成份在动相静相间有不同程度的分布。那些被静相强制滞留的成份，随着流动相缓慢的流动。相对地，成分若仅能微弱的静相抓住，则其移动速度会很快。由于流率不同结果，样品成份乃分离成若干不连续的层带，因此可进行而做定性或定量分析。 4 在正相层析法中，最低极性的成分最先流析出来，相对的在动相中最能溶解；动相极性增加有减少流析时间的效应。在逆相层析法中最高极性的成分最早出现，且动相极性增加就会增加流析时间。表1-1所示为正相与逆相两种层析之特性比较，由于液相层析牵涉到待测成份、固定相、移动相三者间互相作用，因此如何强化固定相与移动相间化学作用特性差异，是决定待测成份滞留有高度选择性的重要关键。 5   种类 Normal phase Reverse phase 固相极性 高极性 低极性 移动相极性 低极性 高极性 先流析出来分析物 低极性 高极性 移动相极性增加 流析时间增加 流析时间减少 表一、正相层析与逆相层析之特性比较 6 层析管柱的选择要领： (1)适合分析液相之样品。 (2)可分析之样品一般较大且因注入样品量及其应用方式之差异可有很多种管柱尺寸供选择。 (3)可使用移动相因所使用的管柱种类及待分析化合物特性而有很多种。 (4)需了解待测化合物的结构及其所含的特殊官能基以方便管柱选择。 除气泡装置 HPLC所使用的溶剂通常会溶解氧气与氮气，所以要把气泡去除才不会影响系统，气泡会影响帮浦的运作、管柱的分离效率、检测器的灵敏度、基线稳定性，还有可能会影响溶剂的pH值造成分析结果的误差。 7 除气泡方法 真空、超音波震荡、加热煮沸、吹氦气等。最常被大家所使用的方法，抽真空与超音波震荡。 8 帮浦装置 帮浦装置，是HPLC重要零件之一，帮浦的好坏会直接影响到整个系统。帮浦应该具有下列几种性能：流量稳定、流量范围大、压力范围大、密封效果高、耐腐蚀。 9 帮浦装置注意事项 禁止任何微粒进入帮浦，因为任何微粒进入帮浦都会造成磨耗，所以要再进入帮浦前先行过滤，以免造成帮浦损坏。 移动相不应该具有腐蚀性物质，缓冲溶液不应该保留在帮浦中。如果留在帮浦中，因为蒸发或泄露可能会有析出结晶体，这些晶体就如同微粒，也会造成损害。因此必须用纯水将帮浦充分清洗，在更换成适合保存的溶剂(例如：甲醇)。 帮浦在运作时，要注意移动相的存量，如果移动相被用完那这样就会吸到空气，空转帮浦也是会造成伤害；注意这些小地方可以使帮浦的寿命延长。 10 样品注射装置 主要是让样品进入HPLC中进行分析的重要装置，目前分为手动注射与自动注射两种。自动注射越来越多人使用，是因为淘汰旧式管路的传送方式以减少样品损失、准确的注射量、确保注射针干净、编排样品程序、操作简单等，而提升使用者的效率。 11 层析管柱 层析管柱是整个系统最重要的核心部分，管柱的长短、内径大小、填充物的材质与颗粒大小，都会对整个系统有影响。正常管柱的寿命为两年以上，填充物质都以二氧化硅为基底，再接上不同的官能基而有不同的分离能力，最适当的 pH 值范围是2~9，根据不同的官能基可以分成正相层析管柱与逆相层析管柱，填充物键结表面为极性物质称为正相，反之填充物键结表面为非极性为逆相。 12 管柱的注意事项 需避免压力和温度的突然改变与震动。 调整移动相比例时，应避免有机溶液与水之比例调整过大，需慢慢改变。 禁止管柱逆相冲提。 选择适当移动相，以免破坏管柱内的固定相。 避免将复杂之样品直接注入HPLC进行分析，以免管柱卡死。 经常使用溶解度较大的溶液清洗管柱，以清除管柱内的杂质。 不使用HPLC时，需选择适当溶液来保护管柱。 13 检测器 检测器式层析仪器中最关键的一个装置，主要是把溶在溶剂中的成份转换成电子讯号传送到计算机中，检测器的要求有以下几点灵敏度高、噪声低、基线平稳、温度无影响检测、线性范围高、再现性高；好的检测器除了要上述条件外，还要有检测极限，这是判断好坏的主要指标，数值越小，性能越好。 14 HPLC的原理 高效液相层析仪根据各种各样的化工互作用力来分离混合物。这种互作用力通常是分析物及分析管柱之间的一种非共价性质。使用高效液相层析时，液体待检测物在不同的时间被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物种不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，每个峰顶都代表一个另外化合物的种类，最后通过分析比对这些信号来判断待侧物所含有的物质。 15 HPLC的用途 高效液相层析作为