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微生物来源透明质酸酶 　　摘要：对微生物来源的透明质酸酶的结构、降解机制、分子生物学与应用等研究现状进行综述。 　　关键词：透明质酸酶；作用机制；基因；微生物 　　中图分类号：Q556文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)09-0040-05 　　 　　透明质酸酶（hyaluronidase）是对催化降解透明质酸酶的通称。两项研究导致了透明质酸酶的发现[1]，一是1928年Duran-Reynals在研究哺乳动物睾丸及其他组织提取物时发现了一种“扩散因子”，可以促进皮下注射的疫苗、染料、毒素等更好地扩散。二是1937年Meyer发现Ⅱ型肺炎链球菌可降解透明质酸（hyaluronic acid，HA）。随后，前面提到的“扩散因子”也被鉴定是透明质酸酶。此后，人们在蛇毒、蜂毒、蝎毒以及蜘蛛等的毒液中都检测到了透明质酸酶。在人体组织及体液中也发现广泛存在着透明质酸酶。此外，一些细菌、真菌以及非脊椎动物如水蛭、甲壳类动物等也产生透明质酸酶。透明质酸酶分布虽广，但在过去很长一段时间里由于分离纯化困难而且似乎研究意义不大，并没有得到很好地研究，是一类被忽视的酶。最近十几年来，人们对HA和透明质酸酶显示出了浓厚的兴趣，试图探求它们在众多生物学过程中的作用。 　　 　　1透明质酸酶的分类 　　 　　1971年，Meyer根据透明质酸酶作用机制的不同，将它分为3类（图1）：(1) 内切-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶（EC 3.2.1.35）为水解酶，作用于β-1,4糖苷键，终产物主要为四糖，也可作用于软骨素或硫酸软骨素，并有转糖苷酶活性。哺乳动物来源的以及动物毒液来源的属于此类。研究最多的是睾丸、蜂毒以及溶酶体透明质酸酶；(2) 水蛭、十二指肠虫来源的透明质酸酶，为内切-β-葡糖苷酸酶（EC 3.2.1.36），作用于β-1,3糖苷键，也是水解酶，主要降解产物是四糖，特异性降解HA；( 3) 细菌透明质酸酶（EC 4.2.2.1），也称为透明质酸裂解酶（hyaluronate lyase），作用于β-1,4 糖苷键，通过β-消去机制得到4,5-不饱和双糖。 　　随着分子技术的发展，根据氨基酸序列的同源性，透明质酸酶也可分为两大类：原核生物透明质酸酶和真核生物透明质酸酶。 　　 　　 　　2底物特异性 　　 　　大多数透明质酸酶不具有底物特异性，也能降解软骨素（chondroitin，Ch）和硫酸软骨素（chondroitin sulfate，Chs）。进化学研究表明[2]，肝素是最早出现的黏多糖，而后是软骨素， HA则晚得多。透明质酸酶很可能是从硫酸软骨素酶发展而来。 　　 　　3降解产物 　　 　　链球菌等致病菌可利用透明质酸酶降解宿主细胞外间质的主要成分HA，破坏宿主的防御系统，促进入侵。细菌透明质酸酶以不饱和双糖为终产物，一些其他的酶可将这些双糖降解为单糖作为碳源和能源被细菌利用。 　　为细菌提供碳源和能源可能是HA被降解为不饱和双糖的原因[3]。因为双糖分子小，便于运输以及进一步降解，而导入的不饱和双键比起水解产物中的单键更便于进一步发生化学反应，利于降解。不饱和双糖与饱和双糖的构象显著不同，更利于反应。 　　 　　4活性测定 　　 　　在几十年的研究过程中，曾经使用很多方法测定透明质酸酶尤其是水解型透明质酸酶的酶活性，不过很多方法现在都基本不用了。1994年Hynes将这些方法分为分光光度法、放射学法、荧光法、酶谱法、平板法以及化学法、物理化学法等。此后又有很多新技术、新方法出现。这些方法中比较经典和常用的有浊度法和Morgan-Elson比色法[4]。此外，还可用紫外微分光谱法检测细菌透明质酸酶不饱和键的吸收。 　　 　　5酶的结构 　　 　　近年开始用X-射线晶体衍射法研究透明质酸酶的结构和作用机制。目前见到报道的有Streptococcus pneumoniae和S. agalactiae（Group B streptococcus，GBS）透明质酸酶。 　　完整的细菌透明质酸酶包含4个结构域：N末端的糖结合域，间隔域，催化反应域，最后是C末端调节域，两个末端结构域与相邻结构域间由一段连接多肽相连（图2）[5,6]。然而，从重组的Escherichia coli得到的完整长度的透明质酸酶不稳定，会发生自动水解。稳定状态的酶由C末端的两个结构域构成，其中催化反应域由α-螺旋结构构成，一般称为α-结构域， C末端调节域则由β-片层结构构成，一般称为β-结构域。 　　 　　α-结构域有一个带正电荷的疏水性裂口（cleft）横贯其中，带负电荷的疏水性底物HA即在此裂口中被结合、降解。催化裂口只能容纳3个双糖结构进入。酶的活性中心位于裂口中间最窄处，由Asn349