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报告基因应用研究进展 　　摘要：目前报告基因作为一种有效技术已在农学、生物医学、生命科学和环境科学等领域起着重要的作用。现以荧光素酶和绿色荧光蛋白为例，综述报告基因的新近应用研究进展。 　　关键词：报告基因；荧光素酶；绿色荧光蛋白 　　中图分类号：R962文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)09-0045-04 　　 　　报告基因（report gene）是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因，将其与目的基因融合表达后，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。这项技术灵敏度高、检测简便可靠、适于大规模生产，因而在监测细胞信号转导，基因表达和药物筛选等方面得到广泛应用。一般的报告基因需要满足以下几个条件：（1）基因被克隆并且已知全序列；（2）宿主不存在报告基因产物或者不存在类似的内源性物质；（3）表达产物易被检测；（4）报告分子的分析结果应具有很宽的线形围，以便分析启动子活性的幅度变化[1]；（5）报告基因在细胞或动物内表达对其正常的生理作用或活性没有影响。现主要以目前应用最广泛的报告基因荧光素酶和绿色荧光蛋白为例，综述报告基因的新近应用研究进展。 　　 　　1荧光素酶（luciferase，luc） 　　 　　luc是能催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。根据来源不同主要分为细菌荧光素酶（bacterial luciferase，BL）、萤火虫荧光素酶（firefly luciferase，FL）以及以海星、发光鱼、发光甲虫等为来源的荧光素酶，目前研究最广泛并且成为商品酶的是BL和FL。BL是由2个多肽亚基组成的异源二聚体，相对分子质量约为79×103，在还原性黄素（FMNH2）、八碳以上长链脂肪醛（RCHO）和氧分子（O2）存在时，发射出蓝绿光（450～490 nm）。FL由单一的多肽链组成，相对分子质量为（60～64）×103，在Mg2+、ATP、O2 存在时催化D-荧光素（D-Luciferin）氧化脱羧发光（550～580 nm）[2]。由于luc的检测方法简便，灵敏度高，因而成为目前应用最广泛的报告基因之一。 　　1.1基因表达研究 　　目前检测luc的灵敏度可达到10～19 mol且价格相对较低，是基因表达研究中首选的报告基因。娄桂予等[3]用luc作报告基因，研究肝细胞核因子1α（HNF1α）对人胆汁??受体（FXR）转录激活的作用机制，发现HNF1α与FXR启动子区域-65到-48的反向半位点结合，发挥反式激活作用，从而调控FXR基因表达。徐春娥等[4]将获得的IFN-β启动子基因连入pGL3-Enhancer载体，用luc作报告基因构建了质粒IP-21，将IP-21瞬转入稳定表达有SARS-CoV非结构蛋白3a和7a的CHO细胞，观察3a和7a对干扰素诱生途径的影响。结果显示，3a和7a蛋白增强了荧光素酶的表达，说明3a和7a能有效激活IFN-β的启动子部分。 　　1.2蛋白质间相互作用研究 　　作为一种酶性报告基因，luc对标记对象和宿主没有损害。特别是可视化检测技术的发展使空间定位观察成为可能，为研究蛋白质的磷酸化、空间表达及蛋白质间的相互作用提供了新的途径。北京大学精神卫生研究所利用嵌合酵母活性转录因子(Gal4)-单纯疱疹病毒蛋白(VP16)-上游激活序列(UAS)和双荧光素酶报告基因系统，建立了检测γ-分泌酶切割阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease, AD）中β-淀粉样蛋白（amyloidβ-protein, Aβ）活性的方法，有效可靠，灵敏度高[5]。 　　1.3毒性物质检测研究 　　传统的利用luc检测毒性物质的原理是毒性物质可能会抑制发光菌发光，根据发光强度的变化判断抑制物毒性作用的大小。但此种方法应用范围较窄，实际操作受限。随着分子生物学技术的发展，人们开始利用基因工程技术将luc报告基因插入某些特异性敏感的基因序列中，构建会发光的生物传感器检测环境中的毒性物质。目前美国Xenobiotic Detection System Intermational公司利用FL作报告基因开发出一种转基因细胞，用于测定样品中二恶英的总毒性当量（total toxic equivalencies，TEQ）。研究表明，二恶英类化合物（dioxin2like chemicals，DLCs或DXNs）产生毒性作用必须与机体细胞核内的二恶英反应增强子结合。根据这一原理，将FL融合入哺乳动物细胞的细胞色素P450基因（CYP1A1）作为报告基因，再转染入H4ⅡE大白鼠肝癌细胞系表达。当外源性DXNs污染物透过细胞膜特异性地与染色体上二恶英应答区域结合，激活细胞色素P450基因和FL基因合成荧光素，此时的荧光强度与DXNs物质的量成正