海洋鱼类致病菌鳗弧菌MVM425毒力质粒pEIB1复制区域最小化分析.docVIP

海洋鱼类致病菌鳗弧菌MVM425毒力质粒pEIB1复制区域最小化分析 　　摘要：目的研究pEIB1复制区域的最小化。方法分析已获得的pEIB1复制区域，设计了7种亚克隆方案。结果在7种亚克隆方案中仅pEIB8，pEIB9和pEIB73获得成功，并且3者的复制特性有差别。结论分析pEIB8，pEIB9和pEIB73携带的复制片段的差别，发现pEIB1复制区域1~360 bp存在的4个质粒复制蛋白结合位点（iteron）与质粒复制拷贝数的控制关系密切。 　　关键词：鳗弧菌；毒力质粒；复制区；亚克隆；质粒复制蛋白结合位点 　　中图分类号：R973文献标识码：A文章编号：1672-979x(2007)04-0001-04 　　Minimization Analysis of Replication Region of Virulent Plasmid pEIB1 from Marine Fish Pathogen Vibrio anguillarum MVM425 　　WU Hai-zhen, ZHANG Hui-zhan, LI Gang, YE Jiang, MA Yue, ZHANG Yuan-xing 　　(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China) 　　Abstract：Objective To minimize the replication region of the plasmid pEIB1. Methods Seven different subcloning projects were designed and carried out after the DNA sequence of pEIB1 replication region was analyzed. Results Only pEIB8, pEIB9 and pEIB73 were obtained among the seven subclones and these three plasmids show difference in replication characters. Conclusion Four iterons among 1~360bp of pEIB1 replication region may be associated with the plasmid copy number control when we analyzed the DNA sequences which pEIB8, pEIB9 and pEIB73 contained. 　　Key words：Vibrio anguillarum; virulent plasmid; replication region; subclone; iteron 　　 　　弧菌病是水产养殖业的最大危害之一，其宿主范围广泛，包括养殖和野生鱼类。据报道，目前已有14个国家出现过弧菌病，侵染了48种海水鱼类[1]。鳗弧菌（Vibrio anguillarum）是海水和淡水养殖鱼类弧菌病的最主要病原菌，属革兰阴性菌，能使鳗鱼患败血症[2]，此种症状与人被Vibrio vulnificus感染产生的败血症非常相似[3，4]。 　　研究表明，鳗弧菌致病的主要原因是携带了约65 kb的毒力型质粒，在铁限制条件下，此质粒编码了高效铁摄取系统克服宿主细胞的非特异性免疫机制，消除此质粒能大幅度降低此病原菌的毒力[2]。 　　在前期研究中，我们从黄海山东海域高密度养殖鲈鱼（Lateolabrax japonicus)爆发的弧菌病病原???内分离到了鳗弧菌MVM425，对其携带的毒力质粒pEIB1进行了序列测定与分析[5，6]，进一步确定了此毒力质粒复制区域的相对位置[6]。目前鳗弧菌类似毒力质粒的复制位点、复制机制、复制拷贝数和控制机制尚未见报道。本研究对上述复制区域进行了DNA序列分析，在此基础上尝试对此DNA序列片段进行多种亚克隆，以期找到毒力质粒pEIB1的最小复制单位（复制位点），为揭示毒力质粒复制的基本特性提供研究基础。 　　 　　1材料和方法 　　 　　1.1菌株、培养基及质粒 　　菌株 Escherichia coli JM83 系本实验室收藏；LB培养基（0.5%酵母粉，1％蛋白胨，1％NaCl），液体或固体培养基37 ℃培养12～16 h。 　　质粒 pEIB7，含鳗弧菌 MVM425毒力质粒 pEIB1复制区域的质粒，由前期研究获得[6]；p