RP—HPLC法测定阿魏酸衍生物的含量测定的方法.docVIP

RP—HPLC法测定阿魏酸衍生物的含量测定的方法_医学检验论文 阿魏酸衍生物（BL）是对阿魏酸（Ferulic Acid，4-羟基-3-甲氧基肉桂酸）苯环进行改造后的化合物，是一个良好的抗氧化剂[1]。文献[2]报道其清除自由基的能力比阿魏酸明显增强。BL结构中溴原子的引入[2]，不仅提高了清除自由基的能力，还明显增大了脂溶性，这有利于其在生物体内的转运与吸收。本文参照文献[3-6]建立了反相高效液相色谱方法，用于测定BL含量及其有关物质，为其质量的可控奠定基础。 1 仪器与试剂 Waters 600-717-996高效液相色谱仪（二元泵，二极管阵列检测器，自动进样器，Millennium32色谱工作站）；电子分析天平（Sartorius，BP211D）；KQ3200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；甲醇（色谱纯，禹王试剂）；乙酸（分析纯，国药集团）；水（娃哈哈纯净水）；30%H2O2（分析纯，国药集团）；盐酸（分析纯，国药集团）；氢氧化钠（纯度：96.0%，西陇化工有限公司）；BL对照品（批号度：99.91%，由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供）；BL供试品（由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供，批号分别20130202。 2 色谱条件与系统适用性试验 采用Agilent Eclipse C18（250mm 4.6mm，5?m）色谱柱；流动相：甲醇-0.1%乙酸（42：58，V/V）；紫外检测器检测波长228nm；流速1.0mL min-1；进样量20?L；柱温：40℃。理论塔板数以BL计算不低于5000，分离度大于1.5，色谱图见图1（主峰保留时间：14.5min，杂质1保留时间：5.8min，杂质2保留时间：12.8min，杂质3保留时间：38.8min）。 3 溶液的配制 3.1 对照品溶液 取BL对照品约10mg，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。 3.2 供试品溶液 取BL供试品约10mg，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 4 方法专属性考察 分别精密称取BL供试品约20mg，置3个25mL棕色量瓶中，加甲醇适量，超声助溶，进行如下破坏试验：①酸破坏：加1mol L-1盐酸1mL，室温下静置17h，用1mol L-1氢氧化钠中和，加甲醇稀释至刻度，摇匀；②碱破坏：加1mol L-1氢氧化钠4mL，室温下静置65h，85℃水浴2.5h，冷却至室温，用1mol L-1盐酸中和，加甲醇稀释至刻度，摇匀；③氧化破坏：加30%双氧水8mL，室温下静置62h，85℃水浴2.5h，冷却至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀。 按照 2 项下的色谱条件，分别取各破坏溶液20?L进样，记录色谱图，见图2。 通过破坏试验可以看出BL 在碱、氧化条件下比较稳定，放置期间有关物质略有增加，在酸性条件下极不稳定，有关物质增加明显，但有关物质均与主峰分离良好，不干扰样品测定，说明该方法专属性好。 5 方法学考察 5.1 线性关系考察 精密称取BL对照品（批号约4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg、16mg分别置于50mL棕色量瓶中，加适量甲醇超声助溶并稀释成约0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL、0.28mg/mL、0.32mg/mL的梯度对照品溶液。分别取上述溶液20?L进样测定，记录色谱图。以峰面积A对浓度C（mg mL-1）进行线性回归，得回归方程 A=84486C-327332（r = 0.9996），表明BL在0.08～0.32mg mL-1浓度范围内呈良好线性关系。 5.2 仪器精密度试验 取浓度为0.20mg/mL对照品溶液，连续进样6次，每次20?L，以峰面积计算，所得RSD为0.57%（n=6），表明测定时的仪器精密度良好。 5.3 重复性试验 取同一批号的BL供试品按 3.2 项下方法操作，配制成0.16mg/mL、0.20mg/mL、0.24mg/mL的低、中、高3个浓度的标准溶液，每个浓度平行配制3份，共9份，照 2 项下色谱条件测定，按外标法以峰面积计算样品含量，测得平均含量为100.35%，RSD为0.50%（n=9），表明方法重复性良好。