人体β防御素突变基因的构建及在大肠埃希菌中的融合表达.docxVIP

人体β防御素3突变基因的构建及在大肠埃希菌中的融合表达【摘要】?目的从人正常皮肤组织中提取β防御素3基因进行定点突变后在中融合表达。方法从人正翅常皮肤组织中提取总RNA勇，经RTPCR扩增得到！编码β防御素3成熟肽テ的cDNA序列，测序正确怼后，寻找合适的突变位点，突设计含突变位点的引物，用ㄧPCR重叠延伸法对β防俣御素3成熟肽cDNA序刍列进行定点突变，将突变产⑺物克隆至pUC18进行序咎列测定及在中融合表达。结游果测序结果表明，经RTPCR所得的β防御素幂3成熟肽序列与GeneB帧ank中报道的编码人β泱防御素3成熟肽的cDN哲A序列完全一致。经过突变甾β防御素3成熟肽第2蕨9位谷氨酰胺密码子由CA艄G突变为精氨酸密码子CG关A，其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β防御素走3基因在中诱导表达3～5h后可见突变β防御素埃3蛋白表达。结论成功构槲建并表达了β防御素3笠突变体基因，为进一步对突雳变体进行真核表达、生物活ш性研究奠定了基础。【关键词】?人体β防御素抿3；定点突变；基因克隆；┩测序；基因表达Cons埃tructionande琳xpressionofa咤sitedirecte岈dmutantgeneo艹fhumanbetadefensin3AB骒STRACT?Objecňtive?Toextra欲ctthegeneenc秸odinghumanbe芷tadefensin蜗3(hBD3)from而humanforeski御ntissue,make坤asitedirect岽edmutagensis梃andexpressionwiththemuta叨ntgenein?Met跞hods?Thetota隋lRNAextractedfromhumanfo贶reskintissue嚆andthesequen髡ceofcDNAenco惧dinghBD3was赐amplifiedbyR菁TPCR.Afters棋equencing,ap怄airofmutantp踬rimerswasdesねignedandsite舳directedmutㄨationwasmadebyoverlapex墉tensionPCRan爻dthenthemuta剃ntgenewasexp尬ressedin?Res搓ults?Sequencツinganalysisi捣ndicatedthat宴hBD3DNAobta骊inedbyRTPCR礁wasidentical颅tothesequenc琨ereportedinGъenBank.After姗mutation,the泐codeCAGforgl蒎utaminewasch徊angedintothe犯codeCGAforar要ginineatposi涌tion29.After箫inductionfor3～5hours,ane鳜wprotEinband⑦appearedonSD涛SPAGEgel.?C带onclusion?Mu裟tanthBD3(mh袜BD3)geneisc膦onstructedan贰dexpressedin⒑BL21successfully.Itmight垦provideafoun蚓dationforconstructionofeukaryoticexp讨ressionvectorandresearch髹ofitsbiologicalactivity.蕃KEYWORDS?Humanbetadefeㄐnsin3;?Site舄directedmutⅫagensis;?Gen箕ecloning;?Se桃quencing;?Geneexpression抗菌肽是生物体产生的一类棚抗微生物的阳离子小分子多颐肽，是生物天然免疫的重要禀组成部分［1］。由于这些缺物质对许多致病菌都有抗菌作用，而且无致畸作用，无平蓄积毒性，最为重要的是在糯机体内不易产生耐药性，因悭此有望开发为新型的抗生素尜，以解决日益严重的传统抗帷生素耐药性问题。防御素(defensin)是近撑年来发现的一组富含半胱氨拦酸残基的抗菌肽，主要存在于上皮组织中，构成机体抵昭御病原微生物侵袭的第一道夼化学屏障［2］。人体β尉防御素3(humanb溉etadefensin龃3，hBD3)是新近逄被克隆出来的第三种人源性唑β防御素。它主要对革兰鲣阳性菌如金葡菌具有高效、剪广谱的杀伤作用，对盐离子巧浓度不敏感，在生理盐浓度哧范围内不易产生溶血现象［堑3］，具有研究和应用价值仙。为了进一步研究hBD慵3的结构与其抗菌活性间的锇关系，我们应用PCR重叠鲣延伸法对hBD3成熟肽讳cDNA的分子结构进行改莫造，得到突变体hBD3诩(muta