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基因枪转化法获得草地早熟禾（Poa 中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2006,26(8):10～14 基因枪转化法获得草地早熟禾 (PoapratensisL.)转基因植株 信金娜韩烈保刘君韩秀宾 (北京林业大学草坪研究所北京100083) 摘要将与植物抗旱耐盐有关的BADH—CMO双基因,CMO单基因,DREB1A单基因三种外源基 因利用基因枪法分别轰击草地早熟禾的胚性愈伤组织,在附加lOOmg/L潮霉素的继代培养基筛 选和附加50mg/L潮霉素的再生培养基中壮苗1个月,将抗性植株移栽到花盆中.经过PCR检 测,Southern杂交分析,证明BADH—CMO双基因,CMO基因,DREB1A基因已经成功整合到草地 早熟禾的植物基因组中. 关键词草地早熟禾BADH—CMO双基因DREB1A基因CMO基因 中图分类号:Q789 DREB1A转录因子可以调控多个与植物干旱,高 盐及低温有关的功能基因的表达,利用转录因子来改 良植物抗逆性,能获得较为理想的综合效果, DREB1A转录因子目前已经成功地用于小麦的遗传转 化.甜菜碱是一类广泛存在于生物体内的渗透保护 剂.高等植物中,甜菜碱的生物合成经由胆碱一甜菜 碱醛一甜菜碱两步反应完成,其中第一步反应,由胆碱 单氧化物酶(CMO)催化,第二步是在甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)的催化下将甜菜碱醛转化为甜菜碱.采用 BADH,CMO单个基因对植物转化已有报道.如沈义国 等获得耐1.2%NaC1盐浓度的转CMO基因烟草植 株,张艳敏等获得了耐盐耐旱性显着提高的转BADH 基因的小麦植株.草地早熟禾是我国北方广泛应用的 草坪草种,以往对草地早熟禾遗传转化多为抗除草 剂,报告基因转化等方面的研究,对草地早熟禾进 行功能基因转化的较少.本试验首次运用本实验室构 建的BADH—CMO双基因对草地早熟禾进行转化,以期 获得较高的抗旱,耐盐性状.同时也把CMO单基因, DREB1A单基因表达载体转化到草地早熟禾愈伤组织 中,获得了草地早熟禾的转基因植株. 收稿日期:2006-05-22修回13期:2006-07-31 国家转基因植物研究与产业化专项项目(J2002一B-006)资助,国 家863计划资助项目(2001AA244082),教育部新世纪优秀人才 支持计划资助项目 }}通讯作者,电子信箱:hanlb@tom.net 1材料和方法 1.1植物材料 供试草地早熟禾品种有:Baron,Mardona, Midnight,采用成熟种子为外植体诱导胚性愈伤组 织,诱导培养基分别为P2:MS+2,4一D(1ing/L)+6-BA (0.1mg/L)+CuSO(3mg/L)+酸水解酪蛋白CH(1g/ L),KM:MS+2,4-D(2mg/L)+6-BA(0.2mg/L)+ CuSO4(3mg/L)+CH(1g/L),P5:MS+2,4-D(2mg/L) +6一BA(0mg/L)+CuSO4(3mg/L)+CH(1g/L)[7i,再 生培养基为AK2:MS+KT(0.2rag/L)+6-BA(1mg/ L),KBN:MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)+NAA (0.5mg/L),AL2:MS+6-BA(1mg/L)+LH(0.5g/L). 经诱导培养基诱导和继代培养的胚性愈伤组织作为基 因枪转化的靶材料. 1.2表达载体 DREB1A基因的表达载体为pCAMBIA1301,包含 DREB1A和Gus基因,分别由ubi及CaMV35S启动子驱 动,筛选基因为hpt(图1).BADH—CMO双基因表达载体 为pCAMBIA1303,包含BADH和CMO基因,分别由ubi及 CaMV35S启动子驱动,筛选基因为hpt(图2);CMO基因表 达载体为pCAMBIA1303,包含CMO和Gus基因,分别由 曲i及CaMV35S启动子驱动,筛选基因为hpt(图3).这些 表达载体均由北京林业大学草坪草实验室构建并保存. 2006,26(8)信金娜等:基因枪转化法获得草地早熟禾(P0.pm把L)转基因植株11 其中DREB1A基因序列长为650bp,BADH基因序列长为 1500bp,CMO基因序列长为1300bp. hpt35SDREBIAUbi35SGIl 图1DREB1A基因表达载体结构图 Fig.1StructureofDREB1Aexpression 图2BADH—CMO双基因表达载体结构图 Fig.2StructureofBADH—CMOdoubleexpression 图3CMO表达载体结构图 Fig.3StructureofCMOexpression 1.3基因枪转化方法 采用美国Bio.Rad公司的PDS一1000/He型基因 枪,具体操作方法参照说明书.具体采用的参