二维色谱-质谱技术在蛋白质组学中的研讨和应用.pdfVIP

二维色谱．质谱技术在蛋白质组学中的研究和应用 摘要 在蛋白质组学研究中，目前采用的技术主要有二维凝胶电泳(2D—PAGE)一 质诺(MS)方法和多维色谱(LC)一质谱方法。随着全自动割胶、酶解、点样 仪的出现，2D技术自动化程度相对提高，整个分析时间也有所缩短，但 是对于等电点极端的蛋白或膜蛋白仍无法达到很好的分离效果。近几年对该方法 进行了～些改进，如对电泳前生物样品进行预浓缩和预分离、分步提取以及对凝 胶的染色过程进行优化，但均未有实质性的进展。发展高通量分析技术平台是蛋 白质组学研究的需要和方向，强阳离子交换(SCX)色谱一反相(RP)色谱一 质谱(MS)技术是其中引人注目的技术平台之一。本论文以二维色谱．质谱技术 为基础，优化蛋白的提取、酶解、前处理以及后继的二维分离条件和步骤，以求 在本实验室建立一个适用于复杂蛋白质混合物分离分析的高通量平台。 本论文的工作主要是围绕二维一色谱．质谱技术来展开的。考虑到酶解步骤在 ShotgUII技术中的重要性，首先利用标准蛋白来考察各种蛋白变性方法对酶活性 以及蛋白去折叠的影响，同时也讨论了蛋白还原烷基化的必要性和有效性。并且 考察了新型去垢剂ALS在蛋白酶解中的应用，与SDS相比，它具有很好的溶解 能力，对酶活性的影响远比SDS小，它在酸性条件下可以自动降解，降解物质 不会影响后继的色谱分离，可以替代SDS来溶解膜蛋白。根据溶液酶解的特点， 结合现有的顺序提取蛋白的方法，对用二维色谱．质谱系统分离鉴定的蛋白提取 方法作了如下改进：将提取步骤分为三步，第一步用水提取偏亲水性蛋白，第二 步用含尿素和硫脲的溶液提取亲水性、中性和偏疏水性蛋白，第三步用去垢剂 ALS代替SDS溶解剩余的不溶物质。 第二部分主要是二维色谱一质谱系统的建立及应用。首先对强阳离子交换色 谱的实验条件进行优化，比较了流动相的pH值、有机溶剂的含量等因素对色谱 分离的影响。根据优化实验条件的结果，以实验室现有的仪器装置为基础，建立 了离线二维系统和在线二维系统。通过肌红蛋白的酶解肽段的分离鉴定，对离线 二维系统中的反相上样时的传输溶液、组分收集时间以及在线系统中的进样盐浓 度等一些参数进行了讨论。并且比较了在线和离线系统，离线系统灵活性比较强， 可以分别优化每一维的实验条件，上样量不受第二维反相色谱的制约，能够富集 低丰度肽段：在线系统整合性比较强，适合于少量样品的分离鉴定，而且对控制 SCX柱的色谱仪损害比较小。最后，利用离线二维系统分离D20裸鼠肝肿瘤组 织的水溶性蛋白，鉴定得到101个蛋白组分，在大分子范围(相对分子量200，000 Da)及碱性范围(pI10)内均有蛋白被检出，蛋白数量也明显多于用2D— PAGE．MS技术鉴定出来的蛋白个数。另外，利用去垢剂ALS溶解红细胞膜蛋白， 用在线二维系统分离鉴定出大量的膜蛋白，弥补了常规的二维凝胶一质谱技术对 膜蛋白的歧视效应， 关键词：蛋白质组学、多维色谱．质谱技术、蛋白酶解、蛋白提取、强阳离子交 换色谱、离线二维系统、在线二维系统 The of2D--LC--MSandIts to Study Applications Proteomics Abstract In are separatedbytwo—dimensional research，proteinstypically proteomic and mass identified digested by polyacrylamideelectrophoresis(2D—PAGE)，then notbe tothoseo