DNA甲基转移酶A siRNA 真核表达载体的构建和鉴定.docxVIP

DNA甲基转移酶3AsiRNA真核表达载体的构建和鉴定【摘要】?目的:构建DNA甲基转移酶3A惠赠，DH5α购自上海生工生物工程技术服务有限公司，人肝癌细胞系SMMC7721购自上海典型培养物保藏中心，限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ、EcoRⅠ、T4多聚核苷酸激酶、DNA连接酶、SYBRpremixExTaqRMKit、TrizolRNA分离试剂购自TaKaRa公司，质粒抽提试剂盒、转染试剂LipofectamineTM2000、RPMI1640培瞢养基来自Invitrogen公司，凝胶回收试剂盒邦为Axygen公司产品，光逆转录试剂盒为Prome倜ga公司产品，胎牛血清、小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司。引物序列由开上海申能博彩生物科技有限椹公司合成。1．2?方法1．2．1?DNMT3A傻靶向siRNA设计与合成?针对人DNMT3A的c娠DNA序列(GenBan煮k_,NM_，NM_),利用Dharmacon公司的在线设计软件siDE抑SIGN(/Design莴Center)寻找候选D≮NMT3ARNAi靶点序列。通过BLAST(/B冱LAST/)同源性比对分术析其是否具有基因特异性。晦根据pSUPEREGF勉P1载体要求设计合成si蟊RNA寡核苷酸模板。寡核氅苷酸序列由上海申能博彩生蛲物科技有限公司合成。1载．2．2?构建DNMT3ぶAsiRNA的稳定表达载操体?将合成的寡核苷酸分别奎溶解在μlH2O中，取1Ⅷμl寡核苷酸,加入48μ餍l的退火缓冲液中,95℃ぅ5min后缓慢冷却退火至圃室温，形成短双链。再与经昼BglⅡ和HindⅢ双酶切的pSUPEREGF撮P1载体连接后转化DH5蚤α感受态细胞,挑取卡那霉事素阳性的克隆，培养后少量不抽提重组质粒，经BglⅡ刑单酶切和EcoRⅠ、Hi擞ndⅢ双酶切鉴定，分别命喻名为pSUPEREGFｕP1S3A1、pSUP兵EREGFP1S3A逯2、pSUPEREGF胨P1S3A3。1．2．3?细胞培养和重组质粒叼转染?肝癌细胞系SMMC┴7721培养于含10％小牛血清的RPMI164啁0培养基中。转染前1d,驮按照2×106瓶-1的浓营度在25ml的细胞培养瓶掉中接种细胞，过夜培养后细扩胞汇合率达到70％～80颛％。转染按Lipofe霈ctinamineTM2000转染试剂说明书操作衔。其中脂质体10μl,重倒组质粒4μg。实验对照组分为只加4μg空载pSU楝PEREGFP1质粒和柄不加质粒只加转染试剂的SⅳMMC7721空白组。我上述转染细胞在37℃、蒎5％CO2培养箱中培养5捋h后，加入含20%小牛血┗清的RPMI1640培养缰液ml,继续培养12h。莓换含10％小牛血清的RPMI1640培养液，继续吆培养72h后，以1∶10企的比例将细胞传代于含抗性砰药物G418的RPMI1蜗640中，进行瞬时表达的谝检测和稳定表达的筛选。包桴含各重组质粒和对照质粒的细胞系分别命名为S3A17721、S3A27忘721、S3A3772锿1、pSUPER772低1。1．2．4?荧光实⒅时定量PCR分析DNMT蛭3AsiRNA载体的沉默於效率?各转染细胞系培养至昙70％～80％汇合时，经歧Trizol一步法抽提总掂RNA,取2μg总RNA陀逆转录获得各细胞系cDN征A第一链。DNMT3A上衡游引物5′TATTGA⑻TGAGCGCACAAG密AGAGC3′,下游引绽物5′GGGTGTTC俩CAGGGTAACATTㄢGAG3′，预期扩增片段长度为110bp[18渗](只扩增NM_,NM_丹，NM_,不扩增NM_1掎75630)；内参βa宸ctin上游引物5′AAAGACCTGTACG⑽CCAACAC3′,下甍游引物5′GTCATA帼CTCCTGCTTGCT霜GAT3′，预期扩增片咣段长度220bp。20μ踺l反应体系包括TaKaR娱a公司SYBRPremi荦xExTaqTM10?μ睥l、上下游引物(10μmol·L-1)各μl、模板cDNA1μl、ddH冯2O8μl。反应条件为9耶5℃5min、95℃15忙s、65℃1min，共4煸0个循环。基因表达的相卫对定量方法按文献推荐方法╇[19]操作。以βactin为对照，获得DNM逐T3A的相对表达差异。每一实验重复3次，每次设置俺3复孔。2?结果2．租1?DNMT3A基因候选siRNA靶序列的筛选和荆合成利用siDESIG笑N软件我们获得8条DNM缛T3A基因候选siRNA泼靶序列。结合Reynol罩ds等[20]总结的si痔RNA设计原则和BLAS‖T比对结果，最终筛选出3颅条候选RNAi靶向序列，每条长度为19nt，分别命名为S3A1、S3A2孬和