水体及土壤样品中类固醇激素的高效检测方法.docVIP

水体及土壤样品中类固醇激素的高效检测方法 　　类固醇激素是一类由胆固醇衍生而来的具有内分泌干扰效应的物质。环境中类固醇激素的主要来源包括人及脊椎动物的排泄、人工合成含类固醇激素药物的使用以及医院或制药厂废水的排放[1-4].人类来源的类固醇激素主要通过污水处理厂处理后排入水体，动物来源的类固醇激素主要通过粪便排泄进入环境体[5-7].由于这类物质具有较强的生物活性，一旦进入水体就可能对非目标生物正常的内分泌功能产生干扰。有报道表明，长期暴露在低浓度的类固醇激素下会对鱼类的生殖系统产生负面影响并导致雌性特征在雄性鱼中出现[8-9]. 　　类固醇激素在环境介质中残留的准确测定是对其进行风险评价和污染防治的基础。目前类固醇激素的分析有气相色谱法、液相色谱法和酶联免疫分析法等[10-12].由于类固醇激素在环境中的浓度通常较低，通常需要对样品进行富集。目前主要采用的富集方法包括固相萃取（SPE）和固相微萃取法（SPME）[13-14].对于土壤及沉积物等固体样品中类固醇激素的测定还需通过溶剂提取。超声提取（USE），加速溶剂提取（ASE）都有运用[15-16].本文采样丹磺酰衍生化的方法提高类固醇激素的电离效率并结合固相萃取和加速溶剂萃取技术，建立了水体及土壤样品中类固醇激素准确、灵敏的检测方法。 　　1材料和方法 　　1.1仪器与试剂 　　Varian 1200LLC-MS/MS电喷雾（ESI）三重四级杆液相色谱质谱联用仪（Varian公司，美国）。Di-onex ASE200加速溶剂萃取系统（Dionex公司，美国）。Nova Pack C18（150×4.6mm,4μm）色谱柱（Waters公司）。ENVI-18（6mL,500mg）和LC-18（3mL,500mg）固相萃取小柱（Supelco公司）。 　　标准物质孕酮（progesterone），醋酸美伦孕酮（melengestrol acetate），雌酚酮（estrone），17α-雌二醇（17α-estradiol），17β-雌二醇（17β-estradiol），雌三醇（estriol）和17α乙炔雌二醇（17α-ethinylestra-diol）购于Sigma公司。内标物质氘代17β-雌二醇（17β-estradiol-D3）和氘代雌三醇（estriol-D2）购于C/D/N Isotopes公司。分析纯药品和色谱纯有机溶剂均购于Fisher公司。 　　1.2样品采集 　　地表水样品采自天然河道，用1L玻璃瓶保存，回实验室后过0.7μm玻璃纤维滤膜并在4 ℃储藏。表层土壤（0~20cm）样品采自一植物园内，冷冻干燥后过筛（　　1.3样品前处理 　　水样 用 固 相 萃 取 方 法 富 集。固 相 萃 取 小 柱（ENVI-18）先后用6mL丙酮和去离子水活化。取过滤后的水样200mL,调节pH值到7,加入40μL浓度为500μg/L的内标后过固相萃取小柱，流速约为10mL/min.随后用含20%丙酮的水溶液清洗。最后用6mL丙酮洗脱。洗脱液用高纯氮气吹干并进行衍生化。 　　土壤样品用加速溶剂萃取法萃取。取过筛的土壤样品5g,加入50μL浓度为500μg/L的内标，同硅藻土混合后装入11mL萃取管，两头用玻璃纤维滤膜密封。优化的萃取条件为：丙酮，温度60℃，压力1500psi,预 热5 min,加 热5 min,淋 洗 体 积60%,吹扫时间2 min,循环2次。萃取液稀释到200mL,然固相萃取方法进行净化和富集，方法同水样。 　　1.4衍生化用 　　100μL碳酸氢钠溶液（0.1mol并用NaOH调节pH值至10.5）溶解氮气吹干的样品，加入100μL丹磺酰氯（1mg/L溶解于丙酮）。震荡混合后置于60℃烘箱内，加热3min.取出样品，氮气吹干并用0.4mL甲醇溶解，转移到2mL样品瓶，储藏于-20℃待分析。 　　1.5仪器分析 　　色谱分析条件为：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流量0.3mL/min.洗脱梯度为：0~5 min,流动相B由40%升至73%,5~25min,升至78%,25~27min升至100%,保持5min后降到40%并平衡6min.定量采用内标标准曲线法。 　　质谱为正离子模式，干燥气体温度300℃，屏蔽电压150V,针电压6 000 V,碰撞气体压力2.0mTorr.其他参数设置见表1. 　　2结果与讨论 　　2.1固相萃取过程优化 　　水体中类固醇激素的提取，我们比较了两种反相固相萃取小柱（ENVI-18和LC-18）的效率。反相吸附剂能够从水体中吸附非极性的物质而对极性物质的吸附能力较弱。本文所研究的目标物质均为弱酸（pKa10），水体的pH值可能会影响固相萃取对目标物质吸附的效率。因此，我们对比了pH值为3和7时两种反