脂氧合酶在胃癌细胞AGS中的表达.docxVIP

15脂氧合酶1在胃癌细胞AGS中的表达作者：林芬，李建英，陈丰霖，陈治新，王小众?【摘要】?目的研究15脂氧合酶1(15LOX1)基因在人胃癌细胞AGS中的表达及其对AGS增殖凋亡的影响。方法通过脂质体介导瞬时转染15LOX1基因于培养的AGS中，逆转录PCR法和免疫印迹法检测15LOX1mRNA及蛋白表达；四甲基偶氮唑盐法、流式细胞术、AnnexinV/PI染色与原位末端标记法比较转染前后AGS的增殖和凋亡情况。结果胃茫癌细胞AGS转染后表达有根15LOX1的mRNγA及蛋白。与非转染组及空拼质粒转染组相比较，转染重昴组质粒组AGS细胞生长明芬显受到抑制并且细胞周期停械滞在G1期，其凋亡率明显高于非转染组及空质粒转染扯组。结论15LOX1基因能够抑制胃癌细胞AG唛S的增殖，并促进其凋亡。【关键词】?花生四烯酸盐沏15脂氧合酶；胃肿瘤；松肿瘤细胞，培养的；细胞增狷殖；细胞凋亡15脂氧炖合酶1(15lipo犊xygenase1,1诏5LOX1)是脂氧合ν酶同工酶的一种，是机体催化花生四烯酸生成活性分子凇从而影响细胞信号传导及代阍谢的关键酶，能够调节恶性怅肿瘤特别是上皮性肿瘤的存僖活。为了解15LOXム1基因与胃癌的关系，本实で验采用体外细胞系基因转染法，研究15LOX1基因转染对胃癌细胞增殖及孵凋亡的影响，以探讨该基因宕与胃癌发生发展的关系及作许为基因治疗的候选基因的可﹃能性。?1?材料与方法1．1?试剂?重组15儇LOX1真核表达载体(谖+)/15LOX1由狎NIH的Eling博士惠绍赠，(+)表达载体由福建么临床免疫研究所郑祥雄教授壅惠赠。质粒抽提试剂盒、逆摹转录试剂盒，脂质体转染试剂盒均购自美国Prome瓒ga公司；RNA抽提试剂盒和AnnexinV/P米I凋亡试剂盒购自深圳生物脖晶美公司；山羊抗人15孑LOX1多克隆抗体购于朊Santacruz公司。圹?方法?重组(+)/梨15LOX1质粒转染止AGS细胞?AGS细胞生寮长于含10%小牛血清的RPMI1640中，以脂质楦体转染的方法分别将(+)危/15LOX1、(+缒)质粒转入细胞中，命名为眵AGS／15LOX1酒、AGS／细胞。步骤如下禄：选取对数生长期细胞，消潸化接种于25cm×25c品m培养瓶，细胞数为1×106L-1，待细胞贴壁，盲取无菌试管加入37℃预热灬的无血清培养基2mL，D刿NA5μg，TransF恪astReagent15饵μL，立即涡旋混匀，室温孜下静置10～15min。蜻小心吸出培养细胞的培养基，稍涡旋混匀脂质体／DNA混合物，加入培养瓶中，耻37℃孵育1h，加入含血柴清的培养基4mL，37℃┵继续孵育48h。?逆转媵录PCR法鉴定15LOX1基因在转染细胞中的镲表达?分别抽提未转染AG赴S，AGS／,AGS／15LOX1三组细胞总壅RNA，取RNA样品2μ滇g，42℃60min，9謇9℃5min进行逆转录合庸成cDNA。15LO翳X1引物上游：5冰GCTGGAAGAGAG泡AAGGAAGTTG3疸下游：5GAAG芽TCAGCTTCGAAC昏AGTGTG3内参承βactin上游：5苓CTATTGGCAA秦CGAGCGGTTC3袭下游：5CTTA徉GGAGTGGGGGTG芹GCTT3取1μL或cDNA进行PCR扩增。给扩增条件：94℃3min襞→94℃45s→57℃4灸5s→72℃1min，2Н5个循环；72℃7min橘。取8μLPCR产物，经③%琼脂糖凝胶中电泳分离,紫外灯下观察结果。?免疫印迹法分析15LOX蹩1蛋白在转染细胞中的表道达?提取转染前后细胞总蛋付白样品，Bradford窜比色法测定蛋白浓度。每孔赧25μg蛋白上样,10%觞SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳荟。蛋白印迹包括电转膜、5婕%脱脂奶粉封闭、一抗(1∶100)4℃过夜、二抗遂(1∶5000)室温轻摇沪60min,用化学发光试施剂盒进行蛋白信号检测。设瘵βactin作为内对照ш。?MTT法检测15愁LOX1对AGS细胞增ヶ殖的影响?250mgMT吓T溶解于50mLPBS(商mol／LpH)，过滤，筅4℃避光保存备用。将AG鄣S细胞用含10%小牛血清的RPMI1640稀释成漕1×104mL-1，接种咧于96孔培养板，分别于培竣养24，48，72，96陶h加入MTT20μL，继柱续培养4h，每孔加入15浅0μLDMSO，振荡10侄min，至结晶充分溶解，水用酶标仪检测在波长490Иnm处吸光度D值，设只加∴培养液，不加细胞的空白对ゆ照孔调零，每组设8个复孔饺，取其均值。以时间(t)ｂ为横轴,吸光度D值为纵轴埝绘制细胞生长曲线，按下面碍的公式计算:细